高强度聚焦超声消融不同范围兔VX2乳腺癌的效应及转归实验研究.docxVIP

? ? 高强度聚焦超声消融不同范围兔VX2乳腺癌的效应及转归实验研究 ? ? 冯潇铃，王琦，杨敏，廖洪建，张志飞，杜永洪 超声医学工程国家重点实验室，重庆医科大学生物医学工程学院，重庆市生物医学工程学重点实验室，重庆 400016；*通信作者 杜永洪 duyonghong@cqmu.edu.cn 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，发病率高，死亡率增长快，目前居全球癌症第1位[1]。常规乳房切除术创面较大，乳房外形受损严重，极大地降低了患者的生活质量[2]。高强度聚焦超声（high intensity focused ultrasound，HIFU）是一种无创治疗肿瘤的综合治疗方式[3-4]，其治疗实体性肿瘤按照外科原则从体外全覆盖、超范围切除体内肿瘤病灶，对于部分因肿瘤体积大、侵犯重要血管或器官而失去外科手术机会的患者，能从体外原位杀灭体内肿瘤细胞、减轻晚期肿瘤疼痛。HIFU技术通过结合药物化疗等综合治疗方式能有效延长患者的生存时间、提高其生活质量[5-6]。 由于乳腺位置表浅，体积较大的乳腺肿瘤进行HIFU完全消融时需要较大的超声能量，长时间辐照易导致患者不耐受或皮肤烧伤、水肿等[7]。此外，因高龄、晚期乳腺癌患者耐受性差及治疗部位的特殊性，HIFU治疗存在不完全消融肿瘤的可能性或临床需求。本研究在超声监控下，通过HIFU消融不同范围兔VX2乳腺癌模型，开展生物学效应及转归等基础实验研究，比较机体免疫转归效应，探索HIFU不完全消融可能引发的凋亡或免疫机制，有望为临床上耐受性差或治疗部位特殊的晚期乳腺癌患者提供HIFU不全消融基础理论参考。 1 材料与方法 1.1 主要材料及仪器 健康雌性新西兰兔（4～6周，2.0～2.5 kg）购自重庆医科大学动物实验中心，VX2种兔由超声医学工程国家重点实验室提供，TUNEL试剂盒（碧云天C1086），增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）鼠抗兔多克隆抗体（博士德生物科技股份有限公司），小鼠Ig-G二步法免疫组化试剂盒（四正柏科技股份公司），ELISA试剂盒（博士德生物科技股份有限公司），聚焦超声肿瘤治疗系统（JC200型，重庆海扶医疗科技股份有限公司，HIFU治疗头频率1.03 MHz，直径158 mm），超声诊断系统（MyLab Class C Advanced），光学显微镜（日本Olympus公司）。 1.2 方法 1.2.1 兔VX2乳腺癌模型建立 采用包埋法建立兔VX2乳腺癌模型，于无菌条件下采用外科手术方式从VX2种兔保种处取长势良好、无坏死的鱼肉样肿瘤组织，切成1 mm3大小的肿瘤块，将其植入兔左侧第二对乳腺内，待肿瘤直径长至1.5 cm左右，通过超声以及病理学HE染色观察细胞结构以验证是否成功建立兔VX2乳腺癌模型[8]。 1.2.2 HIFU辐照 将35只成功建立的VX2乳腺荷瘤兔随机分为对照组（5只）和3个不同范围HIFU消融组（50%、80%及100%组，每组10只）。实验兔术前禁食、禁水并腹部脱毛，术前5 min经耳缘静脉麻醉后将其固定于治疗台上，使肿瘤部位完全浸入脱气水，使用机载超声对兔VX2乳腺肿瘤进行定位，并根据不同的消融范围制订相应治疗计划（50%、80%及100%），勾画出预消融范围。JC200型聚焦超声肿瘤治疗系统以“点-线-面-体”的辐照方式对肿瘤进行消融，超声治疗头从肿瘤中心逐渐往边缘移动辐照，直至覆盖设定范围内的肿瘤。各组HIFU辐照参数一致，每只荷瘤兔每cm3的辐照剂量相同，仅消融范围不同。 1.2.3 肿瘤消融体积测量 采集各组辐照前肿瘤区、辐照后损伤靶区的超声图像，使用软件Microsea HIFU Measurement Software 1.0测量各组辐照前的肿瘤区近似体积及辐照后的强回声靶区近似体积，计算肿瘤消融率；然后通过肿瘤解剖学观察并测量实际消融体积，于术后即刻各组随机处死3只瘤兔解剖取材，将肿瘤沿声束轴方向最大剖面切开后，使用软件测量出各组HIFU消融前肿瘤体积与消融后靶区的凝固性坏死体积，计算各组肿瘤消融率。从两方面共同佐证HIFU不完全消融模型是否成功建立。 1.2.4 HE及免疫组化染色 HIFU消融14 d后各组随机处死3只瘤兔，取完整肿瘤组织，沿超声束入射方向从肿瘤中央切开肿瘤，每个肿瘤组织均选择最大径面（此处切片面积最大，体积具有代表性）制作组织切片。组织于多聚甲醛固定、石蜡包埋后制成石蜡切片，切片一部分行HE染色，观察消融后肿瘤组织的结构损伤及存活区域组织的病理学改变；另一部分行免疫组化PCNA及TUNEL染色，观察各组肿瘤细胞凋亡及增殖情况，以视野出现棕黄色或棕褐色细胞核颗粒为阳性标志。 1.2.5 肿瘤抑制情况观察 HIFU消融后观察各组荷瘤兔的自