风干武昌鱼中鲜味肽的分离纯化及二级结构分析.docxVIP

? ? 风干武昌鱼中鲜味肽的分离纯化及二级结构分析 ? ? 莫加利，陈季旺,2,3,*，刘静泊，舒 静,2，廖 鄂,2,3，夏文水,3，程水源,4 （1.武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023；2.农产品加工与转化湖北省重点实验室（武汉轻工大学），湖北 武汉 430023；3.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；4.国家富硒农产品加工技术研发专业中心，湖北 武汉 430023） 风干武昌鱼是通过自然风干腌制武昌鱼制作的一种发酵鱼，是长江中下游地区的一种传统风味鱼制品[1]。通过酶和微生物的作用，鱼肉中的蛋白质、脂肪和碳水化合物在腌制和风干过程发生降解，形成风干武昌鱼特有的风味。此外，风干武昌鱼中游离氨基酸种类齐全，富含二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，深受消费者喜爱[2]。 鲜味肽是指从食物中提取或者由氨基酸合成的低分子质量的肽，不仅能赋予食品特殊的滋味，而且能改善风味，提升味感[3-6]。科研人员从各种食品及动植物蛋白酶解物中已分离和鉴定了大量的鲜味肽，并研究了这些鲜味肽的结构与鲜味的关系[7-15]。超滤、凝胶过滤色谱、反相高效液相色谱（reversed phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）常用于分离和纯化鲜味肽，基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）和傅里叶变换红外光谱（Fourier translation infrared spectroscopy，FTIR）等可用于测定鲜味肽的分子质量和结构[4-5,9-14]。电子舌是基于非选择性电化学传感器阵列结合化学计量学的方法建立起来的检测体系。作为一种分析、识别和检测复杂呈味物质的仪器，电子舌具有快速、简便、安全、无疲劳等特点，广泛应用于食品领域[16-17]。 本课题组分析了风干武昌鱼的灰分、脂肪、蛋白质和多肽含量、氨基酸和脂肪酸组成及挥发性成分[18]。有关风干武昌鱼中鲜味肽的分离纯化和结构分析的研究鲜见报道。因此，本实验采用电子舌测定鲜味，以及超纳滤、RP-HPLC从风干武昌鱼中分离纯化出纯度均一的鲜味肽，MALDI-TOF-MS、氨基酸自动分析仪、FTIR测定鲜味肽的分子质量、氨基酸组成和二级结构，探讨鲜味肽结构与风味的关系，以为风干武昌鱼的标准化生产提供科学指导。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 风干武昌鱼（每条鱼质量约为258 g，水分40.64%、蛋白质32.72%、脂肪9.40%、灰分9.38%、多肽4.26%）湖北兴兴食品有限公司；三氟乙酸（色谱纯） 美国Sigma公司；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、溴化钾（分析纯）、正己烷（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。 1.2 仪器与设备 LG-3型冷冻干燥机 宁波市生化仪器厂；TS-5000Z电子舌 日本Insent公司；1500 HPLC仪 美国SSI公司；1525-2489 HPLC仪 美国Waters公司；HPS-3超滤膜、卷式芳香聚酰胺纳滤膜 上海摩速有限公司；MALDI-TOF-MS仪 日本岛津公司；NEXUS 670型FTIR仪 美国尼高力仪器公司；L-8900氨基酸自动分析仪 日本日立公司。 1.3 方法 1.3.1 风干武昌鱼水溶性蛋白的提取 将风干武昌鱼去骨后用刀切成块状，加入去离子水，于匀浆机中12 000 r/min匀浆5 min，打碎混匀冷冻干燥后粉碎。取粉碎的鱼肉100 g，正己烷脱脂后加入去离子水，在鱼肉与水的比例1∶10（g/mL），温度40 ℃，时间120 min条件下提取，4 000 r/min离心15 min，取上清液，真空浓缩、冷冻干燥，制得风干武昌鱼水溶性蛋白，-18 ℃冷冻贮藏，备用。 1.3.2 超滤预分离、纳滤脱盐 室温下使操作压力为0.1 MPa，将风干武昌鱼水溶性蛋白用超纯水配成1 mg/mL的溶液100 mL，通过截留分子质量3 kDa的超滤膜进行超滤分离，收集滤过液和截留液，真空浓缩、冷冻干燥，-18 ℃冷冻贮藏，备用；室温下使操作压力为0.5 MPa，将电子舌测得超滤后鲜味较佳的组分用超纯水配成1 mg/mL的溶液100 mL，通过截留分子质量约200 Da的纳滤膜进行纳滤脱盐，收集截留液，真空浓缩、冷冻干燥，制得纳滤脱盐组分，-18 ℃冷冻贮藏，备用。 1.3.3 鲜味肽的理化成分测定 水分含量测定：参照GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》105 ℃恒重法[19]；灰分含量测定：参照GB 5009.4—2016《食品中灰分的测定》550～600 ℃灰化法[20]