WS_T 346-2011网织红细胞计数的参考方法.pdf

ICS 11. 020C 50wS中华人民共和国卫生行业标准WS/T 346--2011网织红细胞计数的参考方法Reference method for reticulocyte counting2012-04-12实施2011-09-30 发布中华人民共和国卫生部发布 WS/T 346---2011前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由卫生部临床检验标准专业委员会提出。本标准主要起草单位：卫生部临床检验中心。本标准主要起草人：彭明婷、谷小林、施丽飞、李臣宾、申子瑜。F WS/T 346—2011网织红细胞计数的参考方法1范围本标准规定了网织红细胞计数参考方法的技术要求。本标准适用于建立并运行网织红细胞计数参考方法的实验室。2　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2. 1参考方法reference method一种可清楚和准确描述的用于特定检测的技术，该技术要有依据，可提供足够准确和精密的实验数据以评价其他实验方法检测结果的有效性。若有决定性方法，参考方法的准确性必须与决定性方法进行比较，并且须标示不准确度和不精密度。3总则为了保证参考方法检测结果的准确性，建立参考方法的实验室必须与其他参考实验室进行结果比对。4原理网织红细胞是未完全成熟的红细胞，其胞质中含有嗜碱性的RNA物质，经碱性染料活体染色后，形成蓝色点粒状或丝网状结构。参考方法中，采用显微镜（明场或相差)对新亚甲蓝活体染色后制备的血涂片进行网织红细胞计数,确定网织红细胞与红细胞的比值后，使用参考方法(ICSH,1994)计数红细胞，网织红细胞比值乘以红细胞计数结果，即为网织红细胞的绝对数。网织红细胞绝对数的表达方式为每升全血中含有网织红细胞的数量。5 血液标本的要求5.1血液标本的采集应使用真空采血管或注射器采血后注入含抗凝剂的洁净试管中，要注意防止溶血。5.2使用 EDTA·K²抗凝剂,加人血液后抗凝剂的终浓度为 3.7 μmol/mL～5.4 μmol/mL(1.5 mg/mL～2.2 mg/mL).5.3标本采集后要求在 4 h 内进行染色。5.4检测前应先轻柔地颠倒试管以混匀标本，颠倒次数至少为8次（试管的最佳颠倒次数取决于试管的种类和容积大小）。血液加人抗凝管后，管内剩余空间应至少占试管体积的20%。5.5不能使用旋涡混匀器和滚轴混匀器。1 WS/T 346—20116染料和染液配制6.1推荐使用的染料为新亚甲蓝。6.2染液的配制方法：将1.0g新亚甲蓝（染料应干燥)溶解于100mLpH为7.4的等渗磷酸盐缓冲液(150 mmol/L 的 NaH2PO4 18 mL,150 mmol/L 的 Na2 HPO4 82 mL)中6.3待染料溶解后，必须充分混匀并过滤，然后将其装人干净的棕色瓶中，避光保存于2℃～8℃条件下,染液可稳定1个月。6.4使用前取适量的染液用过滤器或滤纸（要求孔径为11um)再次进行过滤，以去除沉淀的染料和其他颗粒物质。7实验器具7.1巴斯德移液管。7.275 mmX10 mm 的玻璃试管。7.3载玻片（经酸处理）。8操作过程8.1将 100 μL过滤后的染液加至75 mm×10 mm的试管中,再将约100 μL的全血加至该试管中,加盖并充分混匀后，在室温条件下染色3min～5min。8.2将细胞悬液重新混匀,在载玻片上推成薄血膜。血膜长度至少有2.5 cm，血膜末端离玻片的末端至少有1cm的距离，且整个血膜周边应留有光滑连续的空白区。可用热吹风等方式使血膜快速干燥（避免温度过高或时间过长）。8.3在低倍镜下（总的放大倍数为100倍)先浏览血膜的细胞分布情况，以确认细胞均匀地分布于适当的计数区域内，然后在油镜下计数血膜上的红细胞，如出现任何干扰因素（如原虫、Heinz小体），则不适用于参考方法。9计数9.1要获得准确的计数结果，就必须把每个视野中的成熟红细胞和网织红细胞准确地区分开来。要求由两位经验丰富的检验技术人员通过视频监测器或者两人共用一台双头双筒的显微镜同时计数。9.2每份检测标本都应选用3张血涂片进行计数。9.3计数过程中视野的移动顺序如图1所示。2 WS/T 346—2011计数区域图1网织红细胞计数视野移动顺序示意图9.4计数红细胞的数量应以能够获得满意的精密度为标准（见表1）。9.5成熟红细胞和网织红细胞要分别记录，网织红细胞的比值(rp)可用公式(1)计算：网织红细胞数1rp=成熟红细胞数网织红细胞数9.6网织红细胞绝对数为每升全血中所含的网织红细胞数。该值等于用参考方法计数出的红细胞总数乘以网织红细胞比值。9.7网织红细胞绝对数检测结果变异系数的计算方法见公式(2)：VCVRBc? +CV,?(2)式中：CVRBC计数所得的红细胞数的变异系数；CV,p网织红细胞比值的变异系数。10精密度要求10