SN_T 3677-2013甘蔗壳多胞叶枯病菌检疫鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3677—2013甘蔗壳多胞叶枯病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Stagonospora sacchari Lo Ling2013-08-30发布2014-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局到途星充真伪 SN/T言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、华南农业大学本标准主要起草人：彭仁、习平根、李敏慧、黎财慧、张卫东、廖力、乐海洋、吴长坤、张建军、冯欣、石振。I SN/T 3677—2013甘蔗壳多胞叶枯病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了甘蔗等寄主植物上的壳多胞叶枯病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于甘蔗壳多胞叶枯病菌的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样甘蔗壳多胞叶枯病菌基本信息3学名:Stagonospora sacchari Lo . Ling分类地位：真菌界（Fungi），无性型真菌（Anamorphicfungi），壳多胞属（Stagonospora）。传播途径：主要通过甘燕等寄主植物叶片带菌传播。其他信息参见附录A。4方法原理根据症状检查、保湿培养、分离培养、病菌形态特征和培养性状观察等方法对病原菌进行判定。5仪器和用具5.1仪器体视显微镜、光学显微镜（带显微照相装置）、测微尺、天平（感量0.1g）、超净工作台、光照培养箱等。5.2用具手持放大镜、滤纸、烧杯、培养皿、三角瓶、镊子、剪刀、载玻片、盖玻片、量筒、酒精灯、吸管、解剖针、刀片等。6试剂和培养基6.1试剂琼脂、蔗糖、1%次氯酸钠、70%乙醇等。1 SN/T3677—20136.2培养基马铃薯燕糖培养基（PSA，配方参见附录B)。7现场检疫按照SN/T2122规定结合症状检查进行抽样。重点检查叶片被害情况，受侵染叶片产生细长纺锤形黄褐色的条斑等，详细症状参见附录A。抽取代表性样品送实验室检验。8病原菌鉴定8.1症状检查对于有病征出现的病部，用解剖针挑取或用刀片刮取病组织表面的小黑点制片，置于显微镜下镜检。8.2保湿培养无上述明显症状或看似健康的寄主组织材料，进行保湿培养。将寄主组织材料充分湿润后，置于垫有3层湿滤纸的塑料盒或袋中，在25℃、密闭条件下培养，观察症状的变化，进行显微镜检及病原菌的分离培养。8.3分离培养直接挑取病部的分生孢子器或分生孢子团置手PSA平板上；或采用组织分离培养法，取新鲜病组织，冲洗掉表面的泥土杂物后，用剪刀或解剖刀切取病健交界处组织，切成5mm见方小块，用70%乙醇表面消毒10s~30s，再用1%饮氯酸钠溶液消毒3min~5.min，再用灭菌水浸洗3次，用灭菌滤纸吸干水分后移植在PSA培养基上，在25℃～28/℃、黑暗下培养，长出菌丝后纯化再转至PSA培养基上培养7d~10d。8.4病菌形态特征和培养性状观察显微镜检分生孢子器、产孢细胞和分生孢子的形态特征及大小。在25℃～28℃、黑暗条件下培养，观察记录菌落的生长情况、颜色变化、分生孢子器的形成情况。9鉴定特征9.1病菌形态分生孢子器球形或扁球形，直径为150um～228um，具有稍微向外突起的孔口，孔口直径17.1μm~27.4um，器壁膜质，其厚度为13.7um～17.1um，器壁外层由两到三层不规则的扁平状褐色至黑色细胞构成，内层细胞壁薄，内壁生有许多短小、纤细和无色的产孢细胞。分生孢子梗缺。产孢细胞的长度为41μm～46μm，宽度为10μm~12μm。分生孢子产生在产孢细胞顶端，包埋在胶质中。分生孢子无色，椭圆形，顶端尖细，基部圆形或略微平截，分生孢子直或稍弯曲，（38.5μm～51.5μm）×（9.8μm~22.1μm），通常具有3个隔膜，极少有1个或4个隔膜，分隔处稍缢缩，成熟的分生孢子在每个细胞中包含1～2个油球（图片参见附录C)。2 SN/T 3677—20139.2病菌培养性状在PSA培养基上，病原菌菌落周缘有典型的辐射状菌丝，菌落初为白色至浅肉色，后中央变为深橄榄色或黑色，菌落中央产生分生孢子器。分生孢子器初期为灰白色到浅褐色，后期变为深褐色。10结果判定以分离物的培养特征和培养性状作为鉴定依据，若以上特征与9.1、9.2鉴定特征相符合，判定为甘蔗壳多胞叶枯病菌。11样品保存发现带有甘蔗壳多胞叶枯病菌的样品至少保存.6.个月，以备复验谈判和仲裁。保存期满后，需经灭菌后方可处理。12菌种保存分离到的甘蔗壳多胞叶枯病菌菌种，转人PSA试管斜