SN_T 2615-2010苹果边腐病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2615-2010苹果边腐病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Phialophora malorum (Kidd Beaumont)McColloch2010-05-27发布2010-12-01实施1O中华人民共和国线发布数码防伪国家质量监督检验检疫总局 SN/T2615-2010前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院，中华人民共和国新疆出人境检验检疫局，中华人民共和国浙江出人境检验检疫局。本标准主要起草人：吴品珊、杜洪忠、王文正、吴志毅、严进：A SN/T2615—2010苹果边腐病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了植物检疫中苹果边腐病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于进出境苹果和梨果实中苹果边腐病菌的检疫和鉴定。2原理苹果边腐病菌在寄主上的症状、形态学特征及分子生物学特性是制定本标准的主要依据。3仪器和用具3.1仪器生物显微镜（具测量功能），体视显微镜，超净工作台，光照生物培养箱，天平，高压灭菌器，台式高速离心机，pH计，水浴箱，PCR扩增仪，电泳仪，凝胶成像仪。3.2用具烧杯，三角瓶，量筒，试管，培养皿（直径9m），载玻片，盖玻片，酒精灯，塑料研杆，移液器，移液器吸头，离心管，液氮罐。4试剂和培养基4.1试剂琼脂粉，马铃薯，葡萄糖，乳酸，琼脂糖，无菌双蒸水，液氮Tris-HCI，氧化镁，盐酸，EDTA，氢氧化钠，乙酸钠，氯化钾，Tris，CTAB，TAE，无水乙醇，苯酚，溴化乙锭（EB），三氯甲烷，异丙醇，异戊醇，蛋白酶K，TagDNA聚合酶，dNTP，DNA分子量Marker，PCR特异性引物PMA-1和PMA-2，实时荧光PCR特异性引物PMA-P1、PMA-P2及探针PMA-Probe-457。4.2培养基马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g：1000mL蒸馏水，灭菌。微酸性马铃薯葡萄糖培养基（APDA）：制备1000mLPDA，灭菌后冷却到50℃，加人1.5mL85%的乳酸。5鉴定方法5.1症状检查病害症状参见附录A。 SN/T2615--20105.2分离培养从病健交界处切取边长为5mm~10mm的样品，70%酒精表面消毒10s～30s，放在APDA培养基上，24℃12h光照/12h黑暗培养1周～2周，待真菌菌落出现，转到PDA上。5.3生物学鉴定培养1周后观测记录菌落的颜色、生长速度，分生孢子和产孢细胞的形状、大小等。培养皿观察保留到第3周。5.4分子生物学鉴定5.4.1DNA提取按CTAB方法提取DNA见附录B。5.4.2PCR检测苹果边腐病菌的常规PCR检测方法和实时荧光PCR检测方法见附录B。6鉴定特征6.1生物学特性6.1.1病菌形态菌丝：初期透明，逐渐呈浅褐色、褐色；直径1um～4um，有分隔，稍有分支，常聚集在一起呈绳索状。分生孢子：从内壁芽生式瓶梗状产孢细胞上产生，成熟时脱落，常聚集在粘液中。单细胞、无色、棚圆型，两端通常各有一个油球，抱子大小为（1.5um～4um）（4um～8um）产孢细胞：典型的瓶梗状，单一或簇状的沿菌丝侧生或在菌丝尖端生长，单细胞，5um～10.8um长，基部稍尖、中部膨胀、有收缩的颈，顶部呈杯状张开，其上形成分生孢子。病菌形态图见附录C。6.1.2菌落特征P.malorum在许多培养基上都能生长。菌落羊毛状质地，灰色、橄榄色或深灰色茸毛状，边缘白色，底部呈现黑色，产孢丰富。病菌生长速度较慢，培养1周后菌落直径为20mm左右。6.1.3分子生物学特征常规PCR检测结果，若在471bp处有条带，阴性与空白对照无条带出现。可判定检测结果为阳性。实时荧光PCR检测结果，若供试样品与阳性对照的FAMCt值小于36，可判定检测结果为阳性。7结果判定形态学鉴定中，分离菌的形态特征与鉴定指标吻合，可判定为检出苹果边腐病菌。常规PCR产物与鉴定指标吻合，可判定为苹果边腐病菌。实时荧光PCR检测结果与鉴定指标吻合，可判定为苹果边腐病菌。2 SN/T 2615-20108菌种保藏将分离菌接在PDA培养基的斜面上，待斜面表面布满菌丝后，封好斜面的盖子，置于4℃保存，每年转接复活一次。9复核必要时由专家对检测结果进行复核。3 SN/T2615—2010附录A（资料性附录）苹果边腐病菌的相关资料A.1分类地位英文名：applefruitrot，siderot学名：Phialophoramalorum(KiddBeaumont)McColloch异名:Sporotrichum malorum Kidd Beaumont,Sporotrichum carpogenum Ruehle