嗜血杆菌的分离与鉴定-(1).pptVIP

嗜血杆菌的分离和鉴定 卫生部北京医院 陈东科 概 述 嗜血杆菌属（Haemophilus）属于巴斯德菌科，是专性寄生的苛养性细菌。该属细菌主要寄生在人的咽喉及口腔粘膜，少见于消化道和生殖道。其中流感嗜血杆菌主要引起人类急性化脓感染（急性咽炎、喉炎、气管炎、肺炎、中耳炎、鼻窦炎、心内膜炎、败血症、脑膜炎等）及严重的继发感染，杜克雷嗜血杆菌是引起软性下疳的病原菌。本属细菌对营养要求严格，生长时需血液中存在的生长因子，人工培养时必须供给新鲜血液才能生长，故名“嗜血杆菌”。 寄居在人体的嗜血杆菌 流感嗜血杆菌(H.influenzae) 副流感嗜血杆菌(H.parainfluenzae) 溶血嗜血杆菌(H,haemolyticus) 副溶血嗜血杆菌(H.parahaemolyticus) 嗜沫嗜血杆菌(H.aphrophilus) 副嗜沫嗜血杆菌(H. paraphrophilus） 副溶血嗜沫嗜血杆菌(H. paraphrophaemolyticus) 惰性嗜血杆菌(H.segnis) 杜克雷嗜血杆菌(H.ducreyi) 一 生物学性状 1. 形态与染色： 嗜血杆菌包括一群无动力、无芽胞的革兰阴性小杆菌，从病灶中新分离的菌株多呈球杆状、双球状或短链状，在陈旧培养物中呈多形性（长杆状或呈长丝状），直径通常不超过1μm。 ? 2. 培养特征： 嗜血杆菌对营养要求较高，需氧或兼性厌氧，在补充5~10%CO2的大气中生长良好，最适生长温度为35℃~37℃， pH7.6~7.8，在pH7.6条件下生长最好。 生长需要X因子、V因子或二者之一。X因子是一种对热稳定的血红素及其衍生物，是一种含铁的卟啉，为细菌合成过氧化氢酶、过氧化物酶、细胞色素氧化酶的辅基；V因子是一种对热不稳定的维生素B类物质，是脱氢酶的辅酶，在细胞的呼吸中起递氢的作用。红细胞中富含X 及V因子，但羊血红细胞中含有水解V因子的酶类， V因子依赖性的嗜血杆菌通常不能在含有完整红细胞的羊血琼脂上生长，因而实验室中常用巧克力琼脂培养基上分离培养嗜血杆菌。 3. 生化反应： 发酵葡萄糖及其他碳水化合物，产酸、少数菌株产气，氧化酶、触酶反应不定，能还原硝酸盐为亚硝酸盐。 二 毒力因子 有荚膜的流感嗜血杆菌根据荚膜多糖抗原可分为a、b、c、d、e、f 6个血清型，其中b型的致病力最强，大部分感染由b血清型引起。 b型荚膜物质为线性聚合物，含有核糖、核糖醇和磷酸，或叫作多聚核糖-核糖醇-磷酸（PRP）。PRP荚膜具有抵抗细胞吞噬及中性粒细胞胞内杀伤的作用，可能是构成b型毒力的重要因素。 三 微生物学检查法 1. 标本采集 根据不同感染，分别采取血液、脑脊液、鼻咽分泌物、痰液、脓汁等标本，采取标本时应注意下列事项。 1）尽量在疾病的早期(用抗生素治疗前)采取标本，采集后应立即送检。 2）鼻咽拭子应在取标本前以肉汤湿润拭子，取样后要防止干燥，并立即送检。 3）对心内膜炎、菌血症、败血症患者采取血液标本，最好在发热期间多部位、多次采样。。 4）痰液标本，则首先用灭菌生理盐水将痰液洗3次，然后将痰块打碎，制成悬液。若痰块太硬，可加入等量10g/L的胰蛋白酶,于37℃水浴0.5~1h，将痰块消化后再接种。 2. 直接涂片检查 痰、脓汁、鼻分泌物或溃疡性性病（软性下疳）分泌物可直接涂片，脑脊液须离心后取沉淀物涂片，革兰染色后镜检。查到革兰阴性短小杆菌或多形态杆菌，结合临床症状，可做初步诊断。流感嗜血杆菌还可作荚膜肿胀试验测定其血清型。 3. 嗜血杆菌的分离培养 取标本在巧克力琼脂平板上三区划线接种，以保证长出单个菌落，置35℃，在5~10%CO2的大气中培养24h。 (1)及时处理标本 及时将标本接种到适当的培养基上是提高嗜血杆菌分离率的前提。因为，嗜血杆菌对干燥、对寒冷的抵抗力均较弱，标本在外界环境中暴露时间过长，其存活率降低，不及时接种适当培养基是导致嗜血杆菌分离率低的主要原因。 (2)如何提高嗜血杆菌的分离率？ 嗜血杆菌分离培养基以巧克力琼脂最好，其中在兔血巧克力琼脂上的生长状况好于羊血巧克力琼脂，如兔血来源困难也可用羊血代替，但需补充一定量的V因子（1.5mg/L NAD或2%鲜酵母浸液）。在培养基中加入2％鲜酵母浸液和50％鲜牛肉浸液可使菌落明显增大。 呼吸道标本中的嗜血杆菌在初代培养时，受到革兰阳性细菌的抑制（营养竞争及菌素作用），菌落细小不易与其他细菌相区别，这是造成嗜血杆菌分离率低的直接原因