SN 1164.1-2002牛传染性鼻气管炎病毒分离操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1164. 1---2002牛传染性鼻气管炎病毒分离操作规程Protocol of virus isolation for infectious bovine rhinotracheitis2002-11-25发布2003-05-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1164. 1—2002前言本标推的试验方法是参考国际兽疫局《诊断试验和疫苗标准手册》介绍的方法，并经过长期实践、改进，使之进一步具体化，而形成现行的标准。本标准的附录A为规范性附录。本标由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国云南出人境检验检疫局。本标准主要起草人：苏卫、张晓丁、王涛、李凌枫。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 SN/T 1164. 1—2002牛传染性鼻气管炎病毒分离操作规程1范围本标准规定了牛传染性气管炎病毒分离方法。本标推适用于牛传染性鼻气管炎病毒的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标谁的引用而成为本标准的条款。凡是注目期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。GB/T6682—1992分析实验室用水规格和试验方法（negISO3696：1987）3缩略语下列缩略语适用于本标准。3. 1TCIDso半数组织培养感染量。3. 2IBR牛传染性鼻气管炎。3.3MDBK牛肾传代细胞系。4原理牛传染性鼻气管炎（IBR)是牛的急性传染性疾病。患牛康复后仍可长期带毒。感染IBR病毒的公牛，精液中可能含有病毒。通过对采集病料的检测，以确定是否带有病。5试剂和材料5.1标准阳性血清，阴性血清，由指定单位提供。5.2培养液：配制见附录A。5.3细胞分散液：见附录A。5.4100μl、500ul.微量可调移液器，无菌塑料滴头。5.5无菌6孔、24孔细胞培养板。5.6无菌棉拭子：5mL～10 ml.无菌玻璃试管。5.7本标准所用水应符含GB/T6682一1992中一级水的规格。5.8样品5.8.1呼吸道样品：用灭菌棉拭子伸入鼻道采取分泌物，放人含青霉索1000IU/ml，链霉素1000 μg/mLpH7.2的Earles液瓶中。也可用棉拭子采集眼分泌物放人Earle液中。5.8.2阴道样品：用棉拭子采取脓疱性外阴阴道炎孕期病变时的阴道粘液，放人含青素1 000 IU/mL,链霏素 1 000 μg/ml,pH7.2Earle 液的瓶中。1 SN/T 1164. 1--20025.8.3脑组织样品：在检时无菌采集脑组织样品。5.8.4流产胎儿组织样品：刚死亡的胎儿，立即无菌采集肺、肾、脾等各种组织样品，放人含青霉素1000 IU/mL,链霉素1000 μg/ml，pH7.2Earle液的瓶中，或吸取胸水。5.8.5血清样品：常规无菌采血分离血清。5.8.6精液样品：采集新鲜精液或抛取冷冻精液管。6器械和设备6.1 冰箱、冰柜。6.2二氧化碳培养箱。6.3离心机6.4超声波裂解器。6.5倒置显微镜。6.6 0.45 μm 滤器。7试验方法7.1样品运输采集的样品应立即放人4℃冰箱保存，在24h内送到实验室。7.2样品处理7.2.1收到棉拭子样品后，先经冻融两次，并充分振动、拧干棉拭子，样品经10000r/min离心10min，取上清液作为组织培养的接种材料。7.2.2组织样品：先用Earle液（pH7.0）制成20%的匀浆悬浮液，经10000r/min离心10min，取上清液作为组织培养的接种材料。7.2.3胸水：每毫升加1000Iu青霍素，1000μg链霉素，10000r/min离心10min取上清液。7.2.4精液：将精液作1：5～1：20稀释，反复冻融3次～4次或用超声波处理，10000r/min离心10 min,取上清液备用。7.2.5上述样品制备后可加入适量两性露素或经0.45μm滤器过滤。7.3细胞制备使用三代以内的胎牛肾细胞（BK）、睾丸细胞（BT），细胞浓度约为3×10°/mI。BK或BT细胞的制备：无菌采取初生特牛肾或睾丸，磨碎或剪碎，再用细胞分散液消化制备细胞，加细胞培养液置37℃二氧化碳培养箱，长成良好单层备用。使用MDBK传代细胞，按常规方法培养，长成良好单层备用。7. 4试验程序7.4.1取经过处理的样品0.1ml.接种到已形成良好单层的牛肾或睾丸或MDBK细胞培养板上，每份样品接种四孔。7.4.2置37℃吸附1h.加人含3%犊牛血清（不含IBR抗体）的细胞维持液1ml。置37℃5%二氧化碳培养箱培养，逐日观察细胞病变5d。7.4.3每日观察细胞病变(CPF)情况，详细记录。7