SN_T 3985-2014水生动物链球菌感染检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3985—2014水生动物链球菌感染检疫技术规范Quarantine protocol for infection with streptococcus in aquatic animals2015-05-01实施2014-11~19 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局ARC梦真 SN/T 3985-2014前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草1本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、福建医科大学附属第一医院。本标准主要起草人：王武军、白泉阳、张吉红、高丽钦、郑腾、张体银、于师宇、张志灯、林素洁。1 SN/T 3985—2014水生动物链球菌感染检疫技术规范1范围本标准规定了鱼类链球菌的临床诊断、病原分离、生化鉴定和聚合酶链式反应的检测方法。本标准适用于鱼类链球菌感染的临床诊断、病原鉴定与检疫。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 4789.28　食品卫生微生物学检验•染色法、培养基和试剂GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出人境动物检疫采样GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范3概述鱼类链球菌感染简介参见附录A。4临床诊断4.1 临床症状病鱼呈急性嗜神经组织病症，行为异常，如螺旋状或旋转式游泳，在水面作头向上或者尾向上的转圈游动。身体呈C形或逗号样弯曲。眼眶周围和眼球内出血，眼球浑浊，眼球突出。鳃盖内侧发红、充血或强烈出血。病鱼腹部体表具点状或斑块出血或溃疡。肛门发红。但在高温季节,病鱼呈急性感染时，有可能未表现临床症状时病鱼已死亡。可根据眼球突出、鳃盖内侧出血和异常神经性运动等典型症状作初步诊断。4.2病理变化病鱼心外膜肥厚。腹腔明显出血，肝脏和腹腔脂肪出血。肝脏、胆囊、脾脏肿大、出血，严重时糜烂。肠炎，肠道内有积水或黄色粘液，肛门突出。5实验室诊断5.1设备、材料和试剂5.1.1主要设备3天平:读数精度 0.1 g。1 SN/T 3985—20冰箱。培养箱。恒温水浴锅。生物显微镜。Ⅱ级生物安全柜。红外加热器。台式冷冻高速离心机。PCR仪。0电泳仪。1凝胶成像仪。2灭菌试管。3灭菌吸管。4单道可调微量移液器（2 μl～20 μI,20 μL～200 μL，100μL～l000 μL)及其配套吸头。5.1.2材料和试剂水：符合GB/T6682中三级水的规格要求。除另有规定，所用试剂均为分析纯。普通琼脂绵羊血平板培养基、脑心浸液(BHI)培养基及其琼脂培养基的制备方法见附录B。革兰染色液。过氧化氢酶试剂。细菌生化鉴定管或商品化生化鉴定试剂盒。细菌基因组 DNA 提取试剂盒，商品化DNA扩增试剂盒：一20℃保存，不要反复冻融扩增海豚链球菌16SrRNA的297bp片断的引物序列如下：Sin-F:5-CTAGAGTACACATGTACTTAAG-3Sin-R:5-GGATTTTCCACTCCCATTAC-30扩增无乳链球菌CAMP因子cfb基因的468 bp片断的引物序列如下：Sag-F:5-AAGCGTGTATTCCAGATTTCCT-3Sag-R: 5′-CAGTAATCAAGCCCAGCAA-31其他试剂：无水乙醇、琼脂糖（电泳纯）、分子量标准（100 bp～1000bp）。2电泳缓冲液、电泳加样缓冲液、澳化乙锭（EB)染色液，配制方法见附录B。3商品化DNA纯化回收试剂盒。4海豚链球菌、无乳链球菌标准菌株，由相关菌种保藏机构提供。5.2样品采集对病鱼，急性病例可无菌采集肝、头肾、脾脏等组织，慢性病例可无菌采集脑、头肾、肝、脾脏、眼等组织，以采集病鱼的脑和头肾为佳。采样数量、包装和运输参照GB/T18088和SC/T7103。5.3细菌分离、培养和鉴定5.3.1细菌分离、培养和初步鉴定送检病料的细菌分离和组织触片检查凡是涉及生物安全的操作和处理均应符合GB19489的相关规定。用经红外加热器灭菌并冷却的接种环蘸取病料内部组织后划线接种于普通琼脂绵羊血平板（见B.1），于29℃培养24h，如菌落生长2 SN/T 3985—2014缓慢，可延长至48h后观察，使之形成单个菌落，以供后续鉴定用。同时取病料做组织触片，姬姆萨梁色（按GB/T4789.28的方法进行染色）后镜检，如见球菌则表明病料中可能含有链球菌增菌培养挑取在普通琼脂绵羊血平板上生长的单个可疑菌落分别接种脑心浸液（BHI)培养液和BHI琼脂斜