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电泳法分析;第一节 电泳技术原理;;;;第二节 各种电泳技术; （一）仪器装置（水平式电泳室）;一、纸电泳法;例：三磷酸腺苷二钠片的含量测定 三磷酸腺苷二钠（ATP）在生产过程及贮存期间均易引入二磷酸腺苷（ADP）与单磷酸腺苷（AMP）等杂质。 1 缓冲液与滤纸制备 枸橼酸盐缓冲液（pH3.0） 滤纸甲酸溶液浸泡，水漂洗，烘箱烘干 2 供试品溶液的制备精密称取加水，振摇，取滤液 3 电泳 距底部5cm划基线，干法点样，放置于电泳槽架，电泳1-1.5h，吹干，置紫外灯检视，铅笔划出紫色斑 4 含量测定 剪下供试品斑点和与斑点位置面积接近的空白滤纸，剪成细条放于试管，加盐酸溶液过滤离心取上清液，257nm波长处测吸光度值，计算含量。 ;1 试剂： 缓冲液配置：醋酸-锂盐缓冲液 染色液：甲苯胺蓝溶液 2 操作： 制胶：琼脂糖加水，加热后溶胀，加缓冲液，涂 布玻璃板上 点样与电泳：电泳槽加入缓冲液，凝胶板放置电 泳槽架上 染色：甲苯胺蓝，水洗多余染色液 3 优点：电泳速度快，分辨率高，透明而不吸收紫 外线，区带易染色，样品易回收 ;; 醋酸纤维薄膜由醋酸纤维素加工制成。 1 试剂配置： 巴比妥缓冲液，氨基黑染色液， 漂洗液 透明液 2 操作： 点样，电泳，染色，漂洗，透明，含量测定（洗脱法，扫描法） 3 优点：电泳区带清晰，电泳速度快，蛋白质，染料不吸附，无拖尾现象。 ;; （一）支持介质是聚丙烯酰胺凝胶，是常用的电泳方法。 （二）制备原理 聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺和交联剂亚甲基双丙烯酰胺聚合而成。 化学聚合（过硫酸铵）光聚合 （核黄素） （三）优点： 1 电渗作用小 2 凝胶孔径可按需要控制大小 3 热稳定性好 4 化学纯度高，污染小。 5 280nm 波长处无吸收，利于蛋白质检测。 ;（四）电泳原理： 1 样品浓缩效应 连续系统和不连续系统 浓缩胶：样品浓缩在胶界积聚薄层 分离胶：电泳 2 凝胶分子筛效应 3 电泳分离电荷效应 ;;（五）操作方法 仪器装置：电泳仪和圆盘或平板电泳槽组成 试剂：三羟基甲基氨基甲烷，四甲基乙二胺， 过硫酸铵 操作：制???、标准液与供试液制备 电泳、染色、脱色、检测 相对迁移率计算、扫描 进胶端到供试品或标准品区带的距离 进胶端到溴酚蓝区带的距离 ;（一）原理：根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠SDS按质量比结合成复合物，使蛋白分子所带负电荷远远超过天然蛋白分子净电荷，消除不同蛋白分子电荷效应。蛋白分子相对迁移率大小完全取决于分子量高低。蛋白分子按大小分离。 （二）优点：消除不同蛋白质分子电荷效应干扰，误差小，重复性好，操作简便。 ;（三）操作方法 1 试剂 （1）30%丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺，亚甲基双丙烯酰胺 （2）分离胶缓冲液：三羟甲基氨基甲烷，加水，盐酸调节pH值至8.8 （3）浓缩胶缓冲液：三羟甲基氨基甲烷，加水，盐酸调节pH值至6.8 2 操作 （1）制胶 （2）对照品和供试品溶液制备 （3）电泳 ;（4）固定与染色 考马斯亮蓝染色 银染色 （5）相对迁移率计算 蛋白迁移距离 脱色前胶条长度 脱色后胶条长度 溴酚蓝指示剂迁移距离 ;;（一）原理：等电聚焦就是在电泳槽中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH值梯度，当蛋白质放进此体系时，不同的蛋白质即移动到或聚焦于与其等电点相当的pH值位置上。 （二）优点：分辨率高，等电聚焦区带窄，稳定，精确度高，浓度低样品液可分离，浓缩作用。 ;以A，B两种蛋白质为例，作出它们的净电荷曲线图，横轴代表环境中的pH值，纵轴代表蛋白質的净电荷，在 pH 6.5时，A带有两个正电荷，B带有一个负电荷。使A与B的净电荷为0的pH值分別为pH9和pH5，这就是它们的「等电点」。;（三）pH梯度形成 1 人工pH值梯度：用两种不同pH的缓冲液互相扩散，在混合区形成pH梯度，不稳定，离子运动影响pH梯度。 2 天然pH值梯度：利用两性电解质在电场作用下自然形成pH梯度，电解硫酸钠稀溶液，阳极吸引负电荷聚焦硫酸，阴极吸引正电荷带负电。甲向阳极移动时接近硫酸失电荷到达等电点。具有很高缓冲能力。环境pH等于其等电点。用增加pI级数的方法形成阳极向阴极逐渐升高，稳定的pH梯度。 ;（四）载体两性电解质条件 等电点处具有足够缓冲能力，不能被样品改变pH值梯度，化学