SNT 2051-2008食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法 实时PCR法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2051—2008食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法实时 PCR 法Determination of bovine , ovine, porcine-derived materials infood, cosmetic and feed--Real-time PCR method2008-11-01实施2008-04-29发布中华人民共和国体层波 数180素发布·#1数码防伪国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2051—2008前言本标准的附录 F为规范性附录,附录 A、附录 B、附录 C、附录 D、附录 E为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、宝生物工程（大连)有限公司、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：曹际娟、李晶泉、郑秋月、于爱丽、陈颖、姚珊、谢琰。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2051—2008食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法．实时 PCR 法1 范围本标准规定了食品、化妆品和饲料中牛：羊（绵羊和山羊）、猪源性成分实时PCR检测方法。本标准适用于食品、化妆品和饲料中牛、羊（绵羊和山羊）、猪源性成分的鉴别检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引角文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/neqISO3696:1987)GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义、缩略语下列术语和定义、缩略语适用于标准。3.1术语和定义3.1.1牛源性成分 bovine-derived materials牛种属特异性 DNA片段。3. 1. 2羊源性成分 ovine-derived mdterials羊种属特异性 DNA片段。3.1.3猪源性成分porcine-derived materials猪种属特异性 DNA 片段。3.1.4实时荧光 PCRreal-time fluorescent-PCR实时荧光聚合酶链式反应。3.1.5Ct 值 Cycle threshold Ct每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。3.2缩略语3.2. 1DNA deoxyribonuleic acid脱氧核糖核酸。3. 2. 2PCR polymerase chain reaction聚合酶链式反应。 SN/T 2051—20083.2.3Taq Thermus aquaticu水生栖热菌。3.2.4FAM 6-carboxyfluorescein6-羧基荧光素。3.2.5ROX 5-carboxy-X-rhodamine6-羧基-X-罗丹明。3.2.6HEX 5-hexachloro-fluorescein6-羧基-2,4,4,5,7,7-六氯荧光素。3.2.7COX ICytochrome C oxidase subunit I细胞色素C氧化酶亚单位I。4　原理本标准采用 TaqMan 实时荧光 PCR 技术，根据线粒体 DNA(COX I）基因上动物种间多态性的差异而进行动物源性种类鉴定。本标准应用多色荧光检测技术，采用多重PCR方法。牛、羊、猪源性成分单体系检测时，对反应液中含有的两种不同荧光染料进行双通道同步检测，在同一反应管内对牛或羊或猪的COXI基因及内参照反应同时进行扩增，并通过标记两种不同荧光物质（FAM、HEX)的特异性探针进行特异性杂交，两色荧光同步检测；牛羊源性成分混合体系检测时，对反应液中含有的三种不同荧光染料进行三通道同步检测，在同一反应管内分别对牛、羊特异的 COX I基因及内参照（InternalControl)同时进行扩增，并通过标记三种不同荧光物质（FAM、HEX、ROX)的特异性探针进行特异性杂交，多色荧光同步检测。其中，对内参照反应的检测，可以监控反应是否正常进行，防止假阴性结果。5材料与试剂5.1设备和材料5.1.1实时荧光 PCR检测系统。5. 1.2高速台式冷冻离心机（最高转速12000r/min以上）。5.1.3台式离心机(最高转速 2 000 r/min)。5.1.4振荡器。5.1.5冰箱(2℃～8℃和-20℃或80℃）。5.1.6微量可调移液器及配套吸头（10μL、100 μL、1000 μL）。5.1.7实时荧光 PCR反应管。5.1.8 离心管。5. 1.9水浴槽。5.1. 10 加热器。5. 1. 11可移动紫外灯。5. 1. 12 磁力架。5.2