NY 829-2004牛奶中氨苄青霉素残留检测方法—HPLC.pdf

ICS 67.050x 04NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 829—2004牛奶中氨芊青霉素残留检测方法-HPLCDetermination of ampicillin residue in milk:HPLC2004-09-01实施2004~08-25发布中华人民共和国农业部发布6 NY/T 829—20041前 言本标准的附录 A为资料性附录,附录 B为规范性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。本标准起草单位：农业部饲料质量监督检验测试中心(广州）。本标准主要起草人：罗道棚、曾平、肖田安、邓国东。1 NY/T 829—2004牛奶中氨芒青霉素残留检测方法--HPLC1范围本标准规定了牛奶中氨苄青霉素残留量检测的制样和高效液相色谱测定方法。本标准适用于牛奶中氨芒青霉素的残留量检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件,其必威体育精装版版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3制样3.1样品的制备取适量新鲜或室温下解冻的冷冻空白或供试牛奶。3.2样品的保存20℃以下冰箱中贮存备用。4测定方法4.1方法提要或原理试样先经三氯乙酸溶液沉淀蛋白，上清液中的氨苄青霉素与甲醛在酸性条件下,加热生成2-羟基-3-苯基-6-甲基吡嗪(氨苄青霉素荧光衍生物）,该衍生物用带有荧光检测器的高效液相色谱在激发波长（Er)346 nm、发射波长（Em)422 nm 条件下测定,外标法定量。4.2试剂和材料以下所用的试剂,除特别注明者外均为分析纯试剂;水为符合GB/T6682 规定的二级水。4.2.1氨芒青霉素标准品含氨苄青霉素(Ci6Hr:N,NaO4S)不得少于85.0%。4.2.2乙腈色谱纯4.2.3三氯乙酸4.2.4甲醛溶液4.2.5浓磷酸4.2.6磷酸二氢钾4.2.7磷酸盐缓冲液(0.02mol/L,pH3.5)称取2.7218g磷酸二氢钾，置于1000mL容量瓶中,加水900mL使溶解，再用浓磷酸调pH至3.5±0.05,加水稀释至刻度,摇匀即得。1 NY/T 829—20044.2.8三氯乙酸水溶液(200 mg/mL)称取三氯乙酸 20 g,溶于 80 mL水中,加水稀释至 100 mL,摇匀即得。4.2.9三氯乙酸水溶液(750mg/mL)称取三氯乙酸 75g,加水适量,使溶解,并稀释至 100 mL,摇匀即得。4.2.107%甲醛水溶液量取37%甲醛18.9mL，加水至100mL,摇匀即得。4.2.1120%乙水溶液量取20mL乙腈至100mL容量瓶中,加水稀释至刻度,摇勾即得。4.2.12氨苄青霉素标准贮备液(1000μg/mL)推确称取氨芒青霉素标准品约0.1155g,置100mL容量瓶中,加水溶解并稀释至刻度，制成1000ug/mL标准贮备液，置于4℃冰箱中保存，存放期为1周。4.2.13氨苄青霉素标准工作液精密量取氨苄青霉素标准贮备液适量,用水稀释成适宜浓度的标准溶液(0.001μg/mL～0.100 μg/mL),即得。临用前配制。4.3仪器和设备4.3.1高效液相色谱仪(配荧光检测器)4.3.2冷冻离心机4.3.3分析天平(感量0.0001g)4.3.4旋涡振荡器4.3.5恒温水浴锅4.3.6微孔滤膜(0.45μm)4.4测定步骤4.4.1试样的制备试样的制备包括：-取新鲜或室温下解冻后的牛奶，以3500r/min离心10min,取下层液作为供试试样；-取新鲜或室温下解冻后的空白牛奶，以3500r/min离心10min,取下层液作为空白试样；-取空白试样，添加适宜浓度的标准工作溶液作为空白添加试样。4.4.2提取精密量取试样5.0mL～10mL，置于塑料离心管中,加人三氯乙酸水溶液(750mg/mL)0.5mL±0.01mL,盖紧后剧烈振摇30s。然后,以6500r/min的速度离心10min,量取上清液1mL±0.01mL于10 mL螺口刻度离心管中。4.4.3衍生化在盛有1.0mL离心上清液或标准工作液的10mL螺口刻度离心管中,加人三氯乙酸水溶液(200mg/mL)0.2mL和7%甲醛溶液0.2mL,旋涡混勾20s,加盖拧紧后置于沸水浴中加热30min。取出，冷却至室温,用20%乙水溶液定容至2mL,混勾后，经0.45μm微孔滤膜滤过至样品瓶中，供高效液相色谱分析。4.4.4测定色谱条件色谱柱:Cl8,250 mm×4.6mm(i.d.）,粒径5 μm,或相当者;流动相：磷酸盐缓冲液--乙腈(75+25,/~);流速:1 mL/min;2 NY/T 829—2004荧光检测器：激发波