DB37_T 3630-2019小麦普通腥黑穗病菌分子检测方法.pdf

ICS65. 020. 01B 16DB37山瀘东省地方标准DB 37/T 3630—2019小麦普通腥黑穗病菌分子检测方法Molecular detection methods of Tilletia foetida Tilletia caries2019-07-23发布2019-08-23实施山东省市场监督管理局发布 DB37/T次前言1I1范围.2术语和定义3仪器设备，4主要试剂5分子检测5.1小麦种子中小麦普通黑穗病菌冬孢子基因组DNA提取5.2菌瘘中冬孢子基因组DNA提取5.3引物序列5. 4 PCR 扩增. 5.5电泳检测5.6检测结果判断6结果判定7样品保存8档案保存 DB37/T言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省农业农村厅提出并监督实施。本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省植物保护总站、山东农业大学。本标准主要起草人：于金风、刘存辉、商明清、孙晓风、杨勤民、金扬秀、李洪刚、张德满、张莉、谢传峰、徐鲁、成文华。 DB37/T麦普通腥黑穗病菌分子检测方法1范围本标准规定了小麦普通黑穗病菌的分子检测方法。本标准适用于小麦普通腥黑穗病菌的分子检测。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2. 1小麦普通腥黑穗病菌Ti//et/a foetida Ti//etia car/es指引起小麦普通腥黑穗病的病原菌统称，包括小麦光腥黑穗病菌（Tilletiafoetida）和小麦网腥黑穗病菌（Tilletia caries）两种。2. 2小麦普通腥黑穗病菌分子检测Moleculardetection ofT///etiafoet/daTi//etiacaries指依据小麦光腥黑穗病菌（Tillertia foetida）和网腥黑穗病菌（Tilleriacaries）的ITS序列，设计特异性引物，经PCR扩增获得特异性片段，依据特异性片段的有无进行判断检测。3仪器设备摇床、显微镜、普通离心机、电热恒温水浴锅、移液器、超净工作台、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、锥形瓶、离心管、盖玻片、载玻片、电子天平等。4主要试剂除特别说明外，本标准所用试剂均为分析纯CTAB缓冲液、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇、TE缓冲液、PCR缓冲液、dNTPs、TagDNA聚合酶、DNAmarker、1XTAE缓冲液、琼脂糖、DNALoading缓冲液、溴化乙锭、3mo1/LNaoH溶液、1 Mo1/L HC1 溶液等,5分子检测5.1小麦种子中小麦普通腥黑穗病菌冬孢子基因组DNA提取5.1.1称取50g小麦种子放入250mL维形瓶中，加入100mL无菌去离子水，试验重复3次。5.1.2摇床200rpm振荡5min后，静置10min。收集洗涤悬浮液于100nl离心管，8000rpm离心10min，弃上清，留沉淀。1 DB37/T 363020195.1.3加入1.5mL无菌水，充分混匀，转至2mL离心管中，10000rpm离心5min，弃上清。5.1.4用1ml无菌水冲洗100ml离心管2次，洗涤液一并转移至2mL离心管，10000rpm离心2min，弃上清。5.1.5加入1mL浓度为3mol/L的Na0H溶液，65C恒温水浴30min。取出离心管，用1mol/LHC1溶液中和，10000rp离心2min，吸出上清液，加无菌水冲洗沉淀4次，离心，吸出上清液。5.1.6向离心管内加入700μL预热至65C的CTAB缓冲液，65℃水浴1h，每隔15min颠倒混匀1 次。5. 1. 77待冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），充分混匀，抽提2次~3次。5. 1. 8：10000rpm离心10min，将上清液转移至新的2ml离心管中，加入等体积的氧仿：异戊醇（24：1），充分混匀，抽提2次～3次。5. 1. 910000rpm离心10min，吸取上清液至1.5mL离心管中，加入等体积预冷至-20C的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温放置30min。5.1.1012000rpm离心15min，弃上清液，留沉淀。5.1.11加入1mL70%乙醇冲洗管底的沉淀，12000rpm离心5min，弃上清液，重复2次。5.1.1212000rp离心30s，去除残余的乙醇。5.1.13置于超净操作台内干媒约15min。5. 1. 14加入30~~50μLTE缓冲液溶解DNA注：也可采用经验证等效的该DNA提取试剂盒，按照试剂盒使用说明书提取。5.2i菌瘦中冬孢子基因组DNA提取取小麦病穗中的菌瘦，用锻子压破，释放并收集里面的冬孢子，转至2mL离心管，采用CTAB法（详见5.1.55.1.14）提取冬孢子基因组DNA。