FaesAP2B基因在甜荞长雌蕊长雄蕊突变体lpls的表达分析.docxVIP

? ? FaesAP2B基因在甜荞长雌蕊长雄蕊突变体lpls的表达分析 ? ? 张 娇 王 旋 张良波 刘志雄 (长江大学园艺园林学院，荆州 434025) 甜荞(FagopyrumesculentumMoench.)为蓼科(Polygonaceae)荞麦属(FagopyrumMill)食药同源的杂粮作物,是荞麦属中2个栽培种之一[1]。甜荞籽粒除含大量蛋白质、纤维素、脂肪、淀粉等营养成分外，还含硒、铜等矿物质元素及芦丁等生物活性成分[2～3]，营养价值高，且具保健功效，现越来越受人们的青睐。 甜荞属特殊异花授粉植物，自然群体中pin型和thrum型花植株1∶1分离，同型花自交不亲和，异型花间才能正常授粉结实，人工杂交困难，产量低[4～5]。寻找同型花和异型花间均能正常授粉结实的甜荞新种质，对于开展甜荞杂交育种、提高甜荞产量、新品种培育等均具有重要的理论意义和实际应用价值。课题组在前期育种实践中，从甜荞品种“北早生”群体中发现了长雌蕊长雄蕊“lpls”(Long pistil and long stamen,lpls)自然变异的单株，通过隔离授粉和单粒传法获得了遗传性状稳定、亲和性好、同型花、异型花间均能正常授粉结实的自然变异株系，成为开展甜荞育种工作的重要种质资源(图1)。深入系统研究甜荞lpls突变体花、籽粒发育的过程与分子调控机制，对于该种质的可持续性利用有重要的意义。 图1 甜荞3种花型图 A.thrum型花(短花柱长雄蕊)；B.pin型花(长花柱短雄蕊)；C.lpls突变体花(长花柱长雄蕊)Fig.1 Three flower types of F.esculentum A.thrum flower with short pistil and long stamen; B.pin flower with long pistil and short stamen; C.lpls flower with long pistil and long stamen 在模式植物拟南芥中，AP2基因主要参与花器官和果实的发育调控，促进花分生组织形成[6～8]。本实验以甜荞长雌蕊长雄蕊突变体lpls为材料，通过同源克隆结合RACE技术从甜荞突变体lpls花芽中克隆出了1个甜荞AP2同源基因的cDNA序列，在分析其结构的基础上，通过实时荧光定量PCR技术(quantitative Real-time PCR，qPCR)检测其在甜荞突变体lpls不同营养组织和生殖结构中的表达，以期为后续验证该基因在调控甜荞花发育的生物学功能上提供一定实验基础，并为进一步分析甜荞籽粒及花发育分子机制，及遗传改良积累资料。 1 材料与方法 1.1 实验材料 2018年3月21日，挑选颗粒饱满的甜荞‘lpls’的籽粒播种于花盆中(21 cm×14 cm×20 cm)。待5月盛花期时，分别从不同植株(≥3)上采集根、茎、幼叶、同时剥离花被片、雄蕊和雌蕊，以及发育4 d的甜荞果实于液氮中速冻后置于-80℃冰箱保存备用。 1.2 实验方法 1.2.1 甜荞lpls型花植株总RNA的提取及cDNA合成 取100 mg左右植物材料采用EASY spin植物总RNA提取试剂盒(艾德莱北京)分别提取甜荞的根、茎、幼叶、花被片、雄蕊、雌蕊和发育4 d的果实的RNA。采用HiScriptⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(诺唯赞南京)试剂盒反转录合成第一链cDNA，方法参照说明书。 1.2.2 甜荞FaesAP2B基因的克隆 根据NCBI(/)数据库中公布的本课题组前期克隆的甜荞FaesAP2基因序列(KM386628.1)，在其5′非翻译区(5′UTR)设计克隆FaesAP2B基因的特异性扩增引物GSPAP2B，以甜荞花芽cDNA为模板，用3′-Full RACE Core Set Ver.2.0试剂盒(TaKaRa)扩增甜荞FaesAP2B基因的cDNA序列全长，扩增PCR程序为：95℃预变性3 min，95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸60 s，30个循环，72℃延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离、回收目的片段，经连接、转化、阳性克隆鉴定、测序获得甜荞FaesAP2B基因的全长序列，实验所用引物见表1。 表1 引物名称及序列 1.2.3 蛋白序列比对与分子系统发育分析 将甜荞FaesAP2B基因开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)编码的氨基酸序列在NCBI(/)数据库中进行BLAST同源有哪些信誉好的足球投注网站(/Blast.cgi)，下载甜荞FaesAP2B同源蛋白序列。选取其中已公布的22种来自不同植物的AP2同源蛋白(表2)，用MEGA 5.0软件的ClustalW程序，对选取的序列进行同源比对