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生物学讲稿的学习课件; 外源基因整合的分子生物学鉴定主要有PCR扩增、PCR-Southern杂交、 Southern杂交以及Southern原位杂交和FISH等。;1 利用PCR扩增检测外源基因整合; 斑点杂交可以快速粗略地检测一下植物基因组内是否含有外源基因。; 斑点杂交虽可以简便快速地检测植物染色体DNA中是否含有目的基因及大致的量，但不能反映外源基因整合的更多信息。; 将被检植株的基因组DNA提取出来，用限制性内切酶酶切，生成的酶切片段中，必有外源基因片段或含外源基因序列的片段，用琼脂糖凝胶电泳分离，各片段按分子大小依次分开，排布在凝胶上。; 经烘干或紫外线照射处理，使印迹的各片段与固相膜牢固结合。; 漂洗除去非特异性的结合及未结合的游离的探针。; 实验前要准备好阳性对照、阴性对照、分子量标准DNA样品及待检转化植株总DNA样品。;3）Southern印迹杂交的实验程序;各程序中有关问题阐述如下：;② 酶切反应体系 ; ③ 酶切效果检验;第14页/共61页;④ 凝胶中的DNA变性;⑤ 印迹;印迹方法;⑥ 预杂交;常用的封闭剂有两类，一类是变性的非特异性DNA，如鲑鱼精子DNA、小牛胸腺DNA等。另一类是高分子化合物，如聚蔗糖400(菲可尔)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、小牛血清白蛋白(BSA)，这三种试剂按一定比例配比，就构成Denhardt’s封闭试剂。此外，脱脂奶粉也可使用，还有使用肝素的报道。;⑦ 杂交与洗膜;*洗膜：洗膜是除去游离的及在非特异性位点上结合的探针。洗膜液的温度、离子强度及洗膜时间是影响洗膜效果的三要素。;⑧ 杂交信号的检出 ;※非放射性标记探针的检出;⑨ Southern 印迹杂交结果分析;对于农杆菌介导的转化体，分析的基本方法是用重叠探针杂交，并以转化的外源基因不同拷贝数为对照。其原理是转化植株基因组DNA用限制性内切酶消化时，外源DNA序列会产生四种片段 。;第26页/共61页;第27页/共61页;第28页/共61页;第29页/共61页; 通过对转基因植物Southern印迹杂交的分析，可获得外源基因是否整合到植物基因组中、整合方式及拷贝数的信息。但对于外源基因在植物染色体上整合位点，即整合在哪条染色体的哪个位置上，印迹杂交就难以提供可靠的根据。 因此要想了??外源基因在植物染色体上的整合位置，就需要利用原位杂交技术了。 ; 原位杂交即是通过杂交确定杂交体在样本中的原本位置。这里说的Southern原位杂交是确定外源基因在染色体上的位置，它基于处于分裂过程中的植物细胞染色体可以用光学显微镜观察到，并可以通过染色体的形状以及经不同染色后形成的条带分布来对各染色体进行鉴别及分析。原位杂交以标记的外源基因为探针，在适宜的条件下，探针与固定在玻片上的细胞内变性染色体上互补序列形成稳定的杂交体，然后根据探针的标记性质进行检测，在显微镜下观察。;原位杂交包括取材及材料预处理、固定细胞、细胞的RNase酶解及染色体变性、杂交、检出五个程序。探针的制备与印迹杂交相同。在取材及材料处理上，因要观察的是细胞内的染色体，有丝分裂中期的染色体。取材时应取便于观察染色体的材料，如植物的根尖、茎尖、幼叶、幼小的子叶、茎形成层、居间分生组织、愈伤组织、花蕾、花粉、胚乳等，还要用化学或物理的方法对材料进行预处理，阻断纺锤体微管的形成，使有丝分裂停滞于中期，这样可以得到大量的供实验用的染色体。;目前原位杂交技术存在两个问题： 一是灵敏性不高。 二是有时会出现非特异性杂交。 ;PCR-Southern杂交是一种近年来开始使用的检测外源基因整合的方法。该方法先对被检材料进行外源基因的PCR扩增，然后再用目的基因的同源探针与扩增的特异性条带进行杂交。;1）转基因植株PCR—Southern杂交检测 ;（3）印迹及杂交 将扩增产物电泳后的凝胶碱变性处理后转移到固相膜上，以目的基因为探针进行杂交。操作程序和方法与Southern杂交相同。;（4）杂交结果 凝胶中的特异性扩增条带能发生杂交。非特异性扩增条带不发生杂交，所以阳性对照应产生杂交带，非转化植株无杂交带。各被检植株样品中出现杂交带的可被确定为转基因的。 ;（5）PCR—Southern检测中应注意的问题;③产物特异性不强。应减少引物量及提高退火温度、减少Mg2+浓度。 ④出现引物二聚体条带。首先检查引物是否存在3’端互补的问题，如果无此问题，应减少引物量及循环次数。增加原始模板量及退火温度。;※ 实验操作中要注意防止DNA污染，那怕是痕量的也要防止。操作时要戴一次性的手套。所用的器皿，离心管、吸头等均应使用新的，并要经过高压灭菌。盛有PCR试剂的小离心管打开前应用离心机轻离一下，使试剂沉到管底，这样做可防止取液