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实验二基因克隆一 第一页，共十七页，2022年，8月28日 实验目的 掌握基因组DNA制备的原理和方法 了解DNA限制性内切酶作用特点和酶切消化的操作步骤 第二页，共十七页，2022年，8月28日 实验原理 1. 基因组DNA的提取和纯化 真核生物染色体DNA组装不同层次的结构 第三页，共十七页，2022年，8月28日 核酸分离、纯化原则 保持核酸分子一级结构的完整性； 排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染 ； 无杂核酸分子的污染（如纯化DNA分子时应去除RNA分子）； 第四页，共十七页，2022年，8月28日 基因组DNA制备的基本思路 匀浆组织，破碎细胞 去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子 沉淀核酸 去除盐类、有机溶剂等杂质 纯化干燥 溶解 第五页，共十七页，2022年，8月28日 蛋白酶K和SDS破碎细胞 在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分子分离，EDTA抑制细胞中DNase活性，蛋白酶K将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。 酚/氯仿抽提去除与DNA结合的蛋白质 酚是很强的蛋白质变性剂，氯仿能加速有机相与水相分离，溶解去除残留的酚，且可以去除蔗糖等，在氯仿中加入少量异戊醇可减少蛋白质变性过程中产生的大量气泡。 乙醇和醋酸钾沉淀核酸 核酸为水溶性，在有机溶剂和高盐存在下，核酸在水中的稳定性被破坏，呈不溶状态而沉淀下来。 第六页，共十七页，2022年，8月28日 注意事项 尽量在低温下进行操作； 避免物理因素对核酸的机械剪切； 防止过酸、过碱引起核酸降解，控制pH值范围（pH值5-9），并要保持一定离子强度； 防止核酸的生物降解； 细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。因此，所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。 进行核酸分离时最好新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮中或-70℃冰箱中。 第七页，共十七页，2022年，8月28日 2. DNA限制性内切酶酶切分析 第八页，共十七页，2022年，8月28日 基因工程 第九页，共十七页，2022年，8月28日 pUC18的酶切图谱 第十页，共十七页，2022年，8月28日 DNA的限制性内切酶酶 一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶； 来源于原核生物，功能类似高等动物的免疫系统， 用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭； 水解核酸链中的磷酸二酯键； 第十一页，共十七页，2022年，8月28日 限制性内切酶 酶分子 识别位点 切割位点 限制作用是否需用 ATP Ⅰ类 三亚基双功能酶 二分非对称 至少在识别位点外 1000bp Yes Ⅱ类 内切酶与甲基化酶分子不在一起 4-6bp, 大多数为回文对称结构 在识别位点中或靠近识别位点无特异性 No Ⅲ类 二亚基双功能酶 5-7 bp 非对称 在识别位点下游 24-26bp Yes 限制性内切酶可分为三类 第十二页，共十七页，2022年，8月28日