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如何认识蛋白质类药物纯度检测;1、蛋白质纯度检查 2、蛋白质含量测定 3、蛋白质药物理化性质的鉴定 4、残余杂质检测;1、蛋白质纯度检查;如何认识蛋白质类药物纯度检测？; 3 只用一种方法作为纯度试验的标准是很不可靠的，必须选择多种测定纯度的方法。 最好的纯度标准是建立多种分析方法，从等电点、相对分子质量、疏水性等不同的角度来证明了蛋白质样品的均一性。; 4 纯度最终取决于所用方法的类型和分辨力，低分辨率方法检测合格的样品改用高分辨力方法时就有可能证明它是不纯的。 5 没有一个真正的检验纯度的方法，只有检测样品不纯或非均一的方法。 ;非还原SDS电泳法 银染法染色，加样量不低于5μg。 考马斯亮蓝R-250染色，加样量不低于10μg。 结果应无明显杂蛋白出现，经扫描仪扫描，蛋白量应不低于总蛋白量的95％或98％。;;;2、蛋白质含量测定;凯氏定氮法 不需要昂贵的仪器设备，操作比较繁琐，灵敏度较低(毫克水平)，其结果受非蛋白氮的影响，可用钨酸沉淀法或三氯醋酸沉淀法加以排除。 ;2.2 Folin-酚试剂法(Lowry法) 灵敏范围：5～100μg／ml，该方法适合蛋白质的微量测定。 优点：方法简便，灵敏度较高，较紫外吸收法灵敏10～20倍，较双缩脲法灵敏100倍左右。所用仪器简单，不同蛋白质间的变异少，是蛋白质量化的可靠方法。所需时间：约40min。目前国内外多数重组制品原液蛋白含量用该法进行测定。 ;缺点： 受多种物质干扰，反应速度慢，某些试剂不稳定，蛋自质不可逆变性，芳香族氨基酸比例会影响蛋白检测结果。 ;2.3 BCA法 从Lowry法派生的蛋白含量测定方法。 优点：操作比较简单，采用单一试剂4,4’-二羧酸-2,2’-二喹啉(bicichoninic Acid，BCA)，终产物稳定，比Lowry法的干扰物少；所需时间：2h或过夜。 缺点：反应时间长，蛋白质不可逆变性。灵敏范围：标准分析：10～1200μg／mi；微量分析：0.5~10μg／ml。;2.4 Bradford法 Bradford法是采用考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合的原理，迅速、敏感的定量测定蛋白质的方法。需要时间；10min。灵敏范围：25～200μg／ml；的最小体积??测得的最低蛋白为。 ;;紫外吸收法 灵敏范围～2mg／m1；微管中最低可检出0.1m1(0. 05mg)。 需要的时间：几分钟。方法简单，样品可回收，但结果受光吸收物质影响。 适合于含有共轭双键较多的芳香族氨基酸的蛋白质含量测定。; 该测定方法简单、灵敏、快速，在蛋白质和酶的生化制备中广泛应用，特别是在柱层析分离中，利用280nm进行紫外检测来判断蛋白质吸附或洗脱情况是最常用的方法。如重组尿激酶原(Pro-UK)的质量检测标准中的蛋白含量测定项目就采用此法完成。 优点：快速，非破坏性，直接测定不需要标准品，不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定。 缺点①如果一种蛋白不含苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，它将无法检测；②若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。 ; 2.6 ELISA法 为特异蛋白含量测定方法，具有特异性强，灵敏度高，同时测定样品多等特点，可用于生产过程中目标蛋白含量的测定。;;2.8 SDSCBB G250(Coomassie brilliant blue G-250,CBBG ) 染色-比色法 结合Lowry法等总蛋白含量的测定，可用于复杂的蛋白混合物中目标蛋白的定量测定。 ; 重组制品原液蛋白量少，纯度高，可用Lowry法或Bradford法测定蛋白含量。 细胞因子蛋白含量正逐步采用HPLC法，HPLC法测定蛋白含量能够排除溶剂系统的干扰，特别适用于进行批与批之间的质量控制。 ;3、蛋白质药物理化性质的鉴定;印迹的效率取决于蛋白质从胶上转移到膜上的效率以及蛋白质与膜结合的效率。在印迹实验开始时，蛋白质位于凝胶内部并带有十二烷基硫酸钠(SDS)。SDS的负电性使得SDS蛋白复合物移向正极。在移动过程中，SDS不断地从蛋白质上脱离。当蛋白质到达疏水膜，一些疏水结合位点不带有SDS时，可以与膜发生疏水互相作用。蛋白质结合到膜上，SDS不断地从蛋白质脱离并移向正极而蛋白质则留在了膜上。 ;; 质谱法： 具有准确、快速，重复性好，测定范围广等特点，当相对分子质量小于10 000的蛋白质用上述方法