层析和膜技术在生物制药中的应用.pptxVIP

层析和膜技术在生物制药中的应用第1页/共51页 一. 离子交换层析技术定义：利用溶液中各种带电颗粒与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作称离子交换法。离子交换剂由惰性的不溶性载体，功能基团和平衡离子组成。平衡离子带正电荷的为阳离子交换剂，平衡离子带负电荷的为阴离子交换剂，可见离子交换剂是一类具有活性基团的荷电固相颗粒。第2页/共51页 离子交换层析技术离子交换反应：离子交换剂与交换离子间的作用是由静电引力而产生的，是一个可逆的反应过程，当这个反应达到动态平衡时，其平衡点随着pH、温度、溶剂的组成及交换剂本身性质的改变而变化。例如，向平衡体系中加入过量的X+离子，反应倾向于生成R-SO3-X+。第3页/共51页 离子交换层析技术 由于待分离的溶质分子带有不同性质的电荷和不同电荷量，因而在作为固定相的离子交换剂和流动相的洗脱液之间发生可逆交换作用，并通过调节pH值、或改变同性离子的浓度等方法，使溶质分子移动的速度发生变化，从而达到分离的目的。第4页/共51页 离子交换层析的应用如庆大霉素，小诺霉素的提炼，应用了离子交换技术。 第5页/共51页 庆大霉素的提炼 酸化的目的在于将庆大霉素从菌丝体中释放出来，然后为了便于离子交换，将酸化液中和，再于中性溶液中投入732强酸性阳离子树脂。因为庆大霉素属于碱性抗生素，系有机碱，能与多种酸成盐，在水溶液中以离子状态G+存在，可以为阳离子树脂所吸附，对吸附了庆大霉素的732树脂进行洗涤，先用稀酸洗至无Ca2+、Mg2+，接着用无盐水洗至无Cl-，然后用稀氨洗去小组分杂质，最后用浓氨进行洗脱，洗脱液（解吸液）用711阴离子树脂进行脱色，然后经浓缩，转盐、活性炭脱色，喷雾干燥即得庆大霉素成品。?第6页/共51页 第7页/共51页 离子交换层析的应用 粗卵蛋白的分级分离 卵蛋白中：主要有卵清蛋白54-57%（pI4.5)；蓝清蛋白12-15%（pI6.1)；卵粘蛋白3-4%(pI4.7)。 卵白过滤，用polybuffer74稀释，离心，上PBE94柱，以0.025mol/L咪唑-HCl (pH7.2)平衡，用1:10polybuffer74洗脱，分辨率良好。第8页/共51页 二. 凝胶层析凝胶层析，是指样品混合物通过一定孔经的凝胶固定相，由于流经体积的差异，使不同分子量的组分得以分离的一种分离技术。因整个层析过程与过滤相似也称凝胶过滤。又由于物质在分离过程中的阻滞减速现象，也称排阻层析。或称凝胶扩散层析。凝胶的每个颗粒的细微结构如同一个筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，大的分子被排阻于凝胶颗粒之外，因而也称分子筛层析。第9页/共51页 凝胶层析分离原理 分子筛理论最容易理解，当含有大小分子的混合物品流给凝胶层析柱时，各组分随洗脱液的流动而移动. 大分子进入不了颗粒内部，最先流出；中分子部分地进入颗粒，流出速度中等；小分子进入所有颗粒内部，移动速度慢，最后流出。整个样品接分子量大小顺序先后流出层析柱，从而达到分离。第10页/共51页 凝胶层析分离原理第11页/共51页 凝胶层析分离原理当将含有三种不同分子量物质的混合样品用某种规格的凝胶柱进行分离，然后以洗脱体积为横坐标，各物质浓度为纵座标，即得下图的洗脱曲线。 第12页/共51页 凝胶层析的应用凝胶层析目的（或称分离形式）一般有二种：分组分离和分级分离。分组分离亦称类分离，其目的是将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐的分离,常用Sephadex G-25，因为其分离范围是1,000-5,000，被分离的两组物质的分子量正好落在分离范围的两侧，大分子组为全排阻，而小分子组为全渗入，其Kd值的差可达最大值1。第13页/共51页 凝胶层析的应用分级分离，将分子量相差不很大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白。对于这种分子量相近的物质的分离常常选用排阻限略大于样品中最高分子量的凝胶，即O≤Kd≤1。如果样品中含有3个组分的话，最好一个接近全排阻，另一个接近全渗入，第三个为部分渗入，且分子量大于渗入限的3倍，并小于排阻限的1/3。第14页/共51页 凝胶层析的应用脱盐浓缩去热原分子量测定纯化第15页/共51页 凝胶层析的应用:脱盐和浓缩脱盐和浓缩属类分离，选择凝胶使大分子组为全排阻，小分子组为全渗入（Kd=1）。脱盐用的凝胶多用大粒度的、高交联度的凝胶。 ∵交联度大，凝胶颗粒的强度较好； 粒度大，柱层操作比较便利，流速也高。洗脱多为易挥发盐的缓冲溶液； ∵用水洗脱时，有些蛋白质脱盐后溶解度下降，造成被凝胶粒吸附甚至以沉淀状态析出。样品体积最好不大于内水体积的三分之一，以便得到理想的脱盐效果。第16页/共51页 凝胶层析的应用:脱盐和浓缩方法：柱层析包埋法 样品置于透析袋中埋入干胶颗粒堆