基因工程课件-第4章 非肠道原核细菌基因工程.pptxVIP

第4章 非肠道原核细菌基因工程;E 芽孢杆菌的分泌表达系统;*革兰阳性细菌、好氧、杆状 *一旦营养供应受限即形成芽孢;芽孢杆菌表达外源基因的优、缺点;1、两类复制子： ①金黄色葡萄球菌型复制子，如pUB110、pC194和pE194； ②短小芽孢杆菌型复制子，如pHY481和pWT481。;2、异源启动子： 大肠杆菌系统的启动子结构与芽孢杆菌的高度相似， 异源启动子有效。 ;可诱导型操作子： A.大肠杆菌的lac系统，包括lacI阻遏蛋白编码基因 B.λ或φ105噬菌体的操作子区及温度敏感型阻遏蛋白基因 C.枯草芽孢杆菌蔗糖可诱导基因sacB的调控序列; 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) 短小芽孢杆菌（Bacillus brevis) 地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis);（1）枯草芽孢杆菌;（2）短小芽孢杆菌;（3）地衣芽孢杆菌;D 芽孢杆菌的转化系统;1、短小芽孢杆菌胞壁蛋白操纵子调控元件 中壁蛋白（MWP）和外壁蛋白（OWP）基因组成一个操纵子（cwp），其5’端（0.6kb)基因表达调控序列（由启动子、SD序列、翻译起始位点和分泌信号肽编码序列组成）可用于外源基因的分泌表达。 调控机制： 完整的胞壁阻遏转录，生长稳定期胞壁蛋白的脱落和介质中低浓度的Mg++诱导（去阻遏）分泌表达;;短小芽孢杆菌胞壁蛋白操纵子;2、枯草芽孢杆菌胞外果聚糖酶操纵子调控元件;F 重组芽孢杆菌在昆虫毒素蛋白生产中的应用;; 某些苏云氏芽孢杆菌菌株能同时合成多种不同的杀虫蛋白组分，这些不同的组分对应不同的杀虫谱，基本上可以分为5大类，分别命名为cry I、cry II、cry III、cry IV、cry V基因。;（1）将枯草芽孢杆菌的初级代谢启动子取代杀虫蛋白基因 的自身启动子（全程表达）。 （2）将多种杀虫蛋白基因嵌合在一起进行融合表达，以构 建对抗多种害虫的多价工程菌。 （3）通过基因定向突变技术改变杀虫蛋白的氨基酸序列， 以增强杀虫蛋白的毒性作用，扩展杀虫选择范围。 ;链霉菌的基因工程;革兰阳性、好氧、丝状、原核细菌 生长周期：孢子发芽、营养菌丝和气生菌丝形成、孢子生成 具有完善的代谢和分泌系统，能够分解大多数稳定的生物多聚物以及一些人工合成的高分子化合物 丰富的次级代谢途径以及初级代谢与次级代谢之间的严密调控体系 60％以上抗生素由链霉菌合成;B 链霉菌的载体克隆系统; 变铅青链霉菌66株+天蓝色链霉菌A3(2)株=接合 后者染色体DNA的一段序列转入接合受体菌 SLP1.2 （4 -5个拷贝）;① pIJ702;② pIJ61;③ pIJ922;④ pIJ699;⑤ pIJ486／487;⑥ pKC796;KC噬菌体载体系列;C 链霉菌的宿主转化系统;变铅青链霉菌;1、原生质体转化法;转化操作关键：加入DNA之前原生质体的洗涤、DNA与原生质体混合后，PEG缓冲液的迅速加入;2、原生质体转染法;3、完整菌丝体转化法;D 链霉菌的基因表达调控系统;1、启动子;2、终止子;3、核糖体结合位点;4、密码子;5、基因表达的反式调控元件;E 链霉菌的蛋白分泌系统;1、链霉菌蛋白质的信号肽序列;2、成熟蛋白质对分泌的影响;3、培养基及发酵条件对异源重组蛋白高效分泌表达的影响;4、同源和异源蛋白在重组链霉菌中的高效分泌表达;F 利用DNA重组技术改良抗生素生产菌;已克隆鉴定的抗生素生物合成基因簇;（1）强化表达生物合成途径中的关键酶基因。 （2）定向突变关键酶的编码基因。 （3）随机重组相似的抗生素生物合成途径。