分子生物学与基因工程课件-第六章 分离目的基因.pptxVIP

第六章 分离目的基因;生物材料; 分（离目的基因） 切（割目的基因和载体） 连（接目的基因和载体） 转（入宿主细胞） 筛（选阳性克隆） 表（达目的基因）;分离目的基因的策略;第一节 基因文库构建与目的基因克隆;基因文库的基本概念;基因文库的基本概念;基因组文库（genomic library）;理论最低库容量（N）＝ ;基因组文库的完备性; 例如，人的单倍体DNA总长为2.9 x 109 bp，基因组文库中克隆片段的平均大小为15 kb，则构建一个完备性为0.9的基因组文库至少需要45万个克隆；而当完备性提高到0.9999时，基因组文库至少需要180万个克隆。 ;基因组文库的质量标准;基因组DNA的制备;基因组DNA的切割;例如：已知某目的基因位于1.8 kb的Sal I片段中，将染色体DNA用Sal I切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进行拼接。;载体和受体的选择;从基因组文库中筛选目的基因;基因组文库构建的技术性问题;密集铺板（1-10万）;工作量较大，需要了解目的基因的背景知识;基因组文库重组克隆的排序;基因组文库重组克隆的排序;酶切片段末端标记法;基因组文库重组克隆的排序;;;基因组文库重组克隆的排序;染色体走读法;;cDNA文库（cDNA library）; 真核生物与原核生物基因差异较大，特别是前者常具有内含子结构。如果想通过基因文库筛选分离不具有内含子结构的真核基因，则该文库不能直接采用来自染色体的DNA（即基因组文库），而只能来自mRNA的逆转录cDNA（即cDNA文库）。 ;cDNA文库构建与目的基因分离;cDNA文库的代表性;1. mRNA提取 2. cDNA合成 cDNA第一链的合成 cDNA第二链的合成 3. 双链cDNA的分子克隆 4. 双链cDNA与载体连接，形成重组载体 5. 重组载体导入宿主细胞;cDNA文库构建与目的基因分离;逆转录病毒内的逆转录现象;cDNA文库构建与目的基因分离;cDNA文库构建与目的基因分离;cDNA文库构建与目的基因分离;cDNA文库构建与目的基因分离;载体和受体的选择;cDNA文库构建与目的基因分离;从cDNA文库中筛选目的基因-完备分离程序;从cDNA文库中筛选目的基因-差异分离程序;;并非所有???mRNA分子都具有polyA结构 ; 提取细胞总mRNA，琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标mRNA，由此合成双链cDNA，然后进行克隆。 特异分离程序较适用于mRNA丰度极高的目的基因克隆，如血红蛋白基因等 。;第二节 PCR扩增技术与目的基因克隆;;（1）PCR引物是RNA or DNA？ （2）PCR引物是单链DNA or 双链DNA？ ;实 用 举 例 PCR法克隆Clostridium cellulolyticum（解纤梭菌）的celM基因 （原核基因、无内含子） ; GenBank是美国国家生物技术信息中心 (National Center for Biotechnology Information ，NCBI) 建立的DNA序列数据库，从公共资源中获取序列数据，主要是科研人员直接提供或来源于大规模基因组测序计划。 网址：/ 免费使用，且功能强大、数据齐全。 ;;celM; UniProt是由欧洲生物信息学研究所（European Bioinformatics Institute）、美国蛋白质信息资源（Protein Information Resource）以及瑞士生物信息研究所（Swiss Institute of Bioinformatics）等机构共同组成的UniProt协会（UniProt Consortium）编辑、制作的一个集中收录蛋白质资源并能与其它资源相互联系的数据库，也是目前为止收录蛋白质序列目录最广、功能注释最全的一个数据库。 网址： 免费使用，且功能强大、数据齐全。;;;;;GenBank链接;GenBank链接;存在内含子的真核基因序列如何分析？？;;atgattgtcggcattctcaccacgctggctacgctggccacactcgcagctagtgtgcctcta Gaggagcggcaagcttgctcaagcgtctggggccaatgtggtggccagaattggtcgggtccg Acttgctgtgcttccggaagcacatgcgtctactccaacgactattactcccagtgtcttcc