分子生物学常用技术及其应用课件.pptVIP

分子生物学常用技术及其应用 ;第 一 节基因工程 genetic engineering;重组DNA技术的发展史;; 　　在1865年他根据豌豆七对不同性状的杂交实验，总结出遗传因子的概念以及在生殖细胞成熟中同对因子分离、异对因子自由组合两条遗传规律，也就是人们称为的孟德尔因子和孟德尔定律。他发现了遗传基因原理，总结出分离规律和自由组合规律，为遗传学提供了数学基础，创立了孟德尔学派。 ;; 从1910年到30年代托马斯·亨特·摩尔根及 其助手在果蝇遗传实验中，进一步证实了孟德 尔因子的存在，证实了孟德尔已经发现过的遗传的分离定律和自由组合定律，而且还作出了另外两大重要发现：一是发现基因是在染色体上，二是发现了遗传的基因连锁和互换定律。在果蝇遗传实验的基础上，摩尔根还建立了作为摩尔根理论主要基础的基因学说。 “实验方法的本质在于要求每一种见解或假说都必须通过实验的检验，然后才得以承认其科学地位。”——摩尔根 ;;;;;;一、基因工程的基本概念 ;DNA克隆 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 ;基因克隆示意图;（二）基因工程(genetic engineering) —— 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称 基因工程，又称重组DNA工艺学。 ;限制性核酸内切酶;（一）限制性核酸内切酶;一把特殊的剪刀—限制性内切酶的发现阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖;作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。;作用：限制-修饰系统;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。;3.Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) ;粘性末端与平头末端;　　　Eco R I 5’-G A A T T C- 3’ 3’- C T T A A G- 5’ ;　　　Apa I 5’-G G G C C C- 3’ 3’- C C C G G G- 5’ ;　　Eco R V 5’-G A T A T C- 3’ 3’- C T A T A G- 5’ ;1、DNA连接酶;2. DNA聚合酶;① 要求有DNA单链为模板和3’-OH的引物链 ② 具有5’ 3’聚合活性、 5’ 3’外切酶活性、 和3’ 5’外切酶活性 ③ 要求DNA底物具有5’-磷酸和3’-羟基;（2）主要用途;3. 逆转录酶;4、多聚核苷酸激酶;用途：;5、碱性磷酸酶;6、末端脱氧核苷酸转移酶;三、载体;载体的选择标准;载体的结构特点;（一） 质粒 (plasmid);;pUC系列的特点;?互补 lac Z基因编码大肠杆菌的?－半乳糖苷酶，此酶是乳糖分解过程的重要酶，同时可作用于生色底物X－gal，产生蓝色化合物。 载体中的lac Z’基因编码此酶的N端片段，称?片段。与之相应，采用的受体大肠杆菌lac Z基因缺陷，只能产生酶的C端片段，称?片段。 当?片段与?片段共同存在时具有?－半乳糖苷酶活性，而单独存在时无活性。; λ噬菌体基因组：约50kb的线性双链DNA分子 cos末端：互补的单链末端 2种繁殖方式：溶菌性；溶原性;（三） 粘性质粒(cosmid)－粘粒;酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，猴空泡 病毒，逆转录病毒） ;四、重组DNA技术的基本原理;五、重组DNA技术的基本过程; 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程;（一）目的基因的制备;组织或细胞染色体DNA;;mRNA ;* 化学合成法获取目的基因;（二）外源基因与载体的连接;;不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接; 在