淀粉酶活力的测定.pptVIP

第一页，共十二页，2022年，8月28日 一、实验目的 掌握测定淀粉酶活力的原理和基本方法  第二页，共十二页，2022年，8月28日 二、实验原理 酶是一种具有高度专一性的催化剂。其催化能力的大小用酶的活力来表示。酶活力也称酶活性，是以酶在最适温度、最适pH等条件下，催化一定的化学反应的初速度来表示。 第三页，共十二页，2022年，8月28日 本实验是以一定量的α-淀粉酶液，于37 ℃ 、pH6.8的条件下，在一定的初始作用时间内将淀粉转化为还原糖，然后通过与DNS试剂作用，比色测定求得还原糖的生成量，从而计算出酶反应的初速度，即酶的活力 这里规定，一个淀粉酶活力单位为在37 ℃ 、pH6.8的条件下，每分钟水解淀粉生成1 mg还原糖所需要的酶量。 1 U=1 mg 还原糖/min·mL 酶 第四页，共十二页，2022年，8月28日 三.??实验材料及设备 1、材料 淀粉酶液（粗酶液、盐析液、脱盐液） 2、仪器 分光光度计??恒温水浴??沸水浴 3、器材 刻度试管：?25 mL×17 移 ?液 ?管：?1 mL×3（取稀释后的酶液） 烧??? ?杯： 250 mL×1 滴??? ?管： ?2 洗?耳 ?球：? 2 洗瓶、试管架、移液管架、玻棒：各1 移 液 器：专取NaOH 注 射 器：专取蛋白样品 第五页，共十二页，2022年，8月28日 四、试剂的配制 1、淀粉溶液（0.5%） 称取5 g可溶性淀粉，溶于1000 mL热水中。 2、3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂） 3、磷酸缓冲液（ 0.1 mol/L，pH6.8 ），含0.3% NaCl 4、NaOH溶液（2.5mol/L） 第六页，共十二页，2022年，8月28日 五.??操作步骤 1、淀粉酶的制备 （1）取硫酸铵沉淀法纯化蛋白质实验中获得的粗 酶提取液解冻，取上清液0.05 mL，加蒸馏水稀释到25 mL，摇匀备用 （2）取硫酸铵沉淀法纯化蛋白质实验中获得的盐析蛋白质解冻，取上清液0.05 mL，加蒸馏水稀释到25 mL，摇匀备用 （3）取葡聚糖凝胶层析脱盐获得的蛋白液解冻，取0.05 mL，稀释。 收集1管的同学，将0.05 mL稀释到15 mL 收集2管的同学，将0.05 mL稀释到10 mL  第七页，共十二页，2022年，8月28日 试管排列顺序 空白 F1 B3 B2 F3? F2? F1? B3? B2? B1 F3 F2 1 淀粉 3 2 B1? 粗酶液 盐 析 脱 盐 0 时刻 5 min时刻 装约20 mL淀粉溶液，标记，转至37℃水浴锅中 因淀粉中含有少量还原糖，某些溶液有色素、杂质，需查看酶不水解淀粉的情况 37 ℃ 室温 第八页，共十二页，2022年，8月28日 实验编号 操作 0号管 粗酶液 (1) 盐析液 (2) 脱盐液 (3) 0时刻 5min时刻 0时刻 5min时刻 0时刻 5min时刻 B1 B1’ F1 F1’ B2 B2’ F2 F2’ B3 B3’ F3 F3’ 淀粉酶液 (ml) 0.3 0.2 0.5 H2O (ml) 3.5 pH 6.8缓冲液 各 1 ml 0.3 ％ NaCl 各 1 ml 预热 摇匀， 37 ℃ 水浴 2 min NaOH (ml) 1 1 1 1 1 1 预热的淀粉 各 1 ml，迅速摇匀 酶促反应 37 ℃ 水浴 5 min (准确计时) NaOH (ml) 1 1 1 1 1 1 DNS试剂 各 2 ml，摇匀 显色反应 沸水浴 5 min，冷却，各用水定容至25ml，摇匀 比色 以0号管为空白参比，测定λ=540nm处的吸光值 记录A540 第九页，共十二页，2022年，8月28日