第三章高效液相色谱法.pptxVIP

第三章 高效液相色谱法;高效液相色谱法（HPLC）是60年代末以经典液相色谱法为基础，引入了气相色谱理论与试验方法，流动相用高压泵输送，采取高效固定相和在线检测等伎俩发展而成分离分析方法 。 与气相色谱法相比含有：适用范围广，样品预处理简单，分离效率高，流动相选择范围广，检测方法多为非破坏性，流出组分可回收等优点。;HPLC;正相色谱（normal phase） 流动相极性小于固定相极性分配色谱法称为正相分配色谱。惯用分析柱有: 氨基柱、氰基柱、硅胶柱。 惯用流动相为极性小有机溶剂。 反相色谱（reversed phase） 流动相极性大于固定相极性分配色谱法称为反相分配色谱法。惯用分析柱有：ODS( C18)， C8， C2。 惯用流动相为甲醇-水，乙腈-水。 ;离子抑制色谱（ion suppression chromatography）——调整流动相pH值，抑制组分解离，增加组分在固定相中溶解度，改进峰形，以到达分离有机弱酸和弱碱目标。 离子对色谱（ion pair chromatography）——将反离子加入流动相中，与呈解离状态被测物作用，生成脂溶性中性离子对络合物，从而增加了被测物在非极性固定相中溶解度，改进分离效果，到达分离目标。 惯用反离子有：季铵盐 ——用于酸类 烷基磺酸盐——用于碱类;离子色谱法（ ion chromatography ） 离子色谱是由经典离子交换色谱发展起来一个液相色谱技术，利用物质在离子交换柱上迁移差异而到达分离，用于亲水性阴阳离子测定。依据是否采取抑制柱，可分为抑制型离子色谱和非抑制型离子色谱。;空间排斥色谱（steric exclusion ?） 也称凝胶色谱，依据被分离组分分子尺寸与凝胶空径大小之间相对关系而分离，类似于分子筛作用。在一定分子线团尺寸内，分子越大，保留时间越短。 凝胶渗透——以有机溶剂为流动相 凝胶过滤——以水溶液为流动相 对于相同化学组成高分子化合物，其分子尺寸大小与分子量成正比，所以凝胶色谱能够研究高分子化合物分子量分布。;胶束色谱(micellar chromatography) 表面活性剂在水中超出某一浓度（临界浓度）时，多出表面活性剂不再溶解，聚集而成胶束（胶粒）。 以胶束分散体系为流动相色谱法称为???束色谱法。它流动相为胶束多相分散体系，不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。 因胶束色谱法流动相是多相分散体系，在整个色谱体系中又增加了一相，故也被称为假相色谱（pseudo phase chromatography）。;手性色谱(chiral chromatography) 用于分离手性药品对映体一个有效技术，可分为直接法和间接法两类： 直接法 手性固定相法（chiral stationary phase;CSP) 手性流动相法(chiral mobile phase additive;CMPA) 间接法—手性试剂衍生化法 chiral derivatization reagent,CDR);输液泵 多用柱塞往复泵，柱塞向前运动，液体输出，流向色谱柱；向后运动，将贮液瓶中液体吸入缸体。如此往复运动，将流动相 源源不停地输送到色谱柱中。 柱塞往复泵属于恒流泵，流量不受柱阻影响，泵压最高为400kg/cm2。 这种泵含有清洗轻易，更换流动相方便等优点，但脉动性较大是其缺点。当前多采取双泵赔偿法来克服这一问题。;防止使用对不锈钢有腐蚀性溶剂。 例：硝酸、硫酸、盐酸、卤化物， 四氯化碳与异丙醇或四氢呋喃混 合物，含强络合剂溶液等。;;注意：使用后应清洗！;进样注意点 进样阀废液出口端高度必须与进样针在同一水平位置，以免虹吸作用，使样品向针筒方向回流，或从废液口流出。 使用前后，要用流动相（不含酸碱等缓冲液）或甲醇或水冲洗针孔，用针孔清洗器）。;进样方法 整个定量圈体积进样——为取得好精密度，进样量应大于定量圈量2-5倍以上。因为层流影响，需要有过量样品液来取代管壁上流动相（见下列图）。;;Agilent 1100系列自动进样器不一样进样体积下峰面积精度见下列图;检测器 紫外检测器 可变波长检测器 光电二极管阵列检测器 荧光 电化学 蒸发光散射 质谱;;;;色谱图;荧光检测器 选择性和灵敏度均较紫外检测器高。;泵;原理：利用组分氧化还原反应产生电流改变而进行检测。被测物经过电极表面，在两电极间施加超出该组分氧化或还原电位恒定电压时，组分被电解产生电流，服从法拉第定律： I=n f —— I为电流，n为1mol物质在氧化还原中失去或得到电子数，F为法拉第常数，N为被测物mol量，t为时间。;;蒸发光散射检测器;;色谱柱 色谱柱有柱管和固定相组成，柱管用不锈钢制成，柱长10～30cm