生物化学实验课件-生物化学实验5.pptVIP

实验五纸层析法鉴定转氨酶的转氨基作用 学习纸层析法的基本原理和操作技术 了解转氨酶的转氨基作用 实验目的：????? 思考题： 1、氨基酸体内代谢的途径？ 脱氨基作用。主要方式：氧化脱氨基、转氨基、联合脱氨基及非氧化脱氨基。 2、什么是转氨基作用？ 指在转氨酶的催化下，氨基酸的 α-氨基与α-酮酸的α酮基的互换反应。 3、各种转氨酶中，那两种活性较高？ 4、谷丙转氨酶和谷草转氨酶在什么情况下发生异常变化 ？ 它们的临床意义是什么？ 实验原理： 1、转氨基作用广泛地存在于机体各组织器官中，是体内氨基酸代谢的重要途径。氨基酸反应时均由专一的转氨酶催化，此酶催化氨基酸的α-氨基转移到另一α-酮基上。各种转氨酶的活性不同，其中肝脏的谷丙转氨酶（Glutamic??Pyruvic??Transaminase?,GPT）活性较高，它催化如下反应： ? α-酮戊二酸?+?丙氨酸? ? 谷氨酸? +??丙酮酸 本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，加肝匀浆保温后，在肝细胞的谷丙转氨酶催化下产生丙氨酸，用纸层析法检查谷氨酸的出现，以证明组织内的转氨基作用。 2、纸层析属于分配层析。以滤纸为支持物，滤纸纤维与水亲合力强，能吸收20~22%的水。而且其中6~7%的水是以氢键形式与纤维素的羟基结合，在一般情况下很难脱去，而滤纸纤维与有机溶剂的亲和力甚弱。 纸层析是以滤纸纤维结合水作为固定相，以有机溶剂作为流动相。在用纸层析法分离氨基酸时，由于各种氨基酸在此二相中的分配系数不同，各有一定的迁移率。极性弱的氨基酸，易溶于有机溶剂即分配系数小，随流动相移动较快，Rf值大；而极性强的氨基酸相反，据此可以分离鉴定氨基酸。 思考： 本实验层析过程中，哪一种氨基酸距离原点最远？为什么？ 谷氨酸（极性）和丙氨酸（非极性）是理化性质不同的两种氨基酸，前者为亲水性，后者为疏水性氨基酸，据此二者在固定相（水）与流动相（酚试剂）中的分配程度不同，因而流速不同。 3、本实验用圆滤纸进行水平型层析，除待测液外，点加对照液和标准液，层析后用茚三酮法显色，对此观察色斑，判定结果。 3、本实验用圆滤纸进行水平型层析，除待测液外，点加对照液和标准液，层析后用茚三酮法显色，对此观察色斑，判定结果。 茚三酮反应原理 茚三酮在弱酸性条件下和a-氨基酸反应时氨基酸被氧化分解生成醛放出NH3 和CO2，水合茚三酮则变成还原型茚三酮。还原型茚三酮与NH3 及另一分子茚三酮进一步缩合生成蓝紫色化合物最大吸收值的波长为570nm，此反应为一切a-氨基酸所共有。脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色化合物最大吸收值的波长在440nm 。 此反应十分灵敏，根据反应所生成的蓝紫色的深浅，在570nm波长下进行比色就可测定样品中氨基酸的含量，也可以在分离氨基酸时作为显色剂对氨基酸进行定性或定量分析。 多肽和蛋白质虽然具有茚三酮反应，但肽链越大灵敏度也越差，故不宜作定量测定。在多肽合成中常用来检验有无自由氨基的肽类存在。 a-氨基酸 水合茚三酮 醛 还原型茚三酮 还原型茚三酮 茚三酮 蓝紫色化合物(570nm) 脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色化合物(440nm) 弱酸 玻璃匀浆器、离心管、10ml试管、培养皿、表面皿、水浴锅、恒温水浴箱、10cm圆滤纸、吹风机、手术剪刀。 实验器材： 实验试剂： 1、0.01mol/L?pH?7.4磷酸盐缓冲液。 2、0.2mol/L?Na2HPO4 溶液81ml与0.2mol/L?NaH2PO4 溶液 19ml混匀,用蒸馏水稀释20倍。 3、0.1mol/L 丙氨酸溶液 称取丙氨酸0.891克,先溶于少量0.01mol/L?pH?7.4磷酸盐缓冲液中,以1.0?N?NaOH 仔细调至pH7.4后,?加磷酸盐缓冲液至100ml。 ? 4、?0.1mol/L α-酮戊二酸?? 称取α-酮戊二酸1.461g，先溶于少量0.01mol/L?pH?7.4磷酸盐缓冲液中，以1.0?N?NaOH仔细调至pH?7.4?后，加磷酸盐缓冲液至100ml。 5、0.1mol/L?谷氨酸溶液 称取谷氨酸 0.735g，先溶于少量0.01mol/L pH?7.4磷酸盐缓冲液中，以1.0?N?NaOH 仔细调至 pH?7.4?后，加磷酸盐缓冲液至50?ml。 6、0.5% 茚三酮溶液 称取茚三酮0.5g 于100?ml丙酮中溶解。 7、层析溶剂  酚 ：水=?4 ：1（V/V）混匀备用。现用现配。 实验操作: 1、匀浆制备 取新鲜动物肝2克，剪碎后放入研钵中，加入3ml冷0.01mol/L pH=7.4 磷酸盐缓冲液，迅速匀浆，备用。