平行单细胞转录组和染色质可及性测序揭示重编程轨迹的多样性.docxVIP

平行单细胞转录组和染色质可及性测序揭示重编程轨迹的多样性 导读 为了解结构异质性并揭示成功重编程的机制，本研究采用单细胞RNA测序（scRNA-Seq）和单细胞转座酶可及染色质分析（scATAC-Seq）对不同时间点的重编程细胞进行了分析。研究分析表明，重新编程的细胞以异步轨迹进行，并分化成不同的亚群。并鉴定了荧光探针和表面标记，以丰富早期重编程的人类细胞。此外，表面标记的组合使用使得具有不同重编程倾向的早-中期细胞能够很好地分离。scATAC-Seq分析进一步揭示了负责重编程过程调控阶段的基因组分区和转录因子。FOSL1和以TEAD4为中心的调控网络之间的二元选择决定了成功重新编程的结果。 实验设计 本研究使用OSKM经典方法对人源成纤维细胞进行重编程诱导，再通过基于微流控芯片系统的分离技术，对33468个细胞进行两种单细胞测序，建立测序文库，进行参考成分分析和基因表达差异分析，发现细胞在重编程过程中表现出了极其丰富的多样性。进一步使用10X单细胞转录组库对不同时间点数据进行了细胞轨迹的构建。然后对荧光标记分子库进行了筛选，发现荧光染料BDD2-C8能有效的区分出重编程能力更强的细胞。研究对经过CD13分离的D8细胞建立10X单细胞转录组文库，并对在中间状态中「互斥」的转录因子FOSL1和TEAD4进行验证。 结果 1??人类细胞命运重编程的单细胞谱分析 ? 为了研究人类重编程的异质性，共分析了第0天（BJ）、第2天（D2）、第8天（D8）、第12天（D12）和第16天（D16）OSKM诱导的重编程细胞制备的33468个scRNA-Seq和scATAC-Seq文库（图1A）。D16时，利用多能干细胞特异性表面标记物TRA-1-60分选细胞，区分成功重编程（D16+）和非重编程（D16-）细胞（图1A）。产生的诱导多能干细胞（iPSCs）用免疫染色、DNA甲基化和畸胎瘤实验进行表征（图1）。在这项研究中，使用两种截然不同的方法进行scRNA-Seq文库制备（图1A）。此外，还筛选了荧光探针来区分准备成功重编程的早期中间细胞（图1A），为上游TF制备了染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）文库，解析其调控网络（图1A）。大多数基于捕获的scRNA-Seq文库表现出较高的外显子定位百分比（≥75%）和基因检出率（≥20%），在基因体上分布均匀（图1B和1C）。此外，与间充质和成纤维细胞基因相反，上皮和多能性基因随着重编程的推进而逐渐表达。同样，大多数10X文库质量良好（图1G，1H）。UMAP聚类发现从亲代BJ到D16+细胞的动态转录组转变（图1D）。预期ZEB1（间充质）和COL1A1（体细胞）在早期时间点和非重编程细胞中大量表达（图1E和1F）。相反，EPCAM（上皮）和NANOG和LIN28A（多能性）在成功重编程的细胞中高表达（图1E，1F）。同样，大部分scATAC-Seq文库通过了之前报道的质量控制指数，并表现出转录起始位点（TSS）区域和核小体分布的富集（图1G-1I）。总的来说，研究结果为数以万计的重编程细胞生成了可靠的单细胞文库，为破译其深层分子机制提供了丰富的资源。 ? 图1.?用于消除人类细胞重新编程中的异质性的单细胞系统。（A）在人类细胞重新编程的不同时间点上准备的单细胞NGS文库概述。利用微流控平台制备了439个scRNA-Seq和891个scATAC-Seq文库。利用10x基因组学平台制备了32138个高质量的scRNA-Seq文库。（B）基于微流控捕获的scRNA-Seq文库的质量控制。Dotlot显示了每个scRNA-Seq文库的外显子映射百分比（x轴），以及相应的检测到的基因率（y轴）。（C）基于捕获的scRNA-Seq文库相对于遗传体的平均富集。（D）制备的10X scRNA-Seq文库的UMAP图。（E和F）MET基因（E）和成纤维细胞和多能基因（F）的表达水平重叠。（G）SCATAC-Seq文库的质量控制。Dotlot展示了每个scATAC-Seq库的库大小（x轴），以及它对各个时间点的HAR的贡献（y轴）。（H）D16+scATAC-Seq文库在基因组转录起始点（TS）附近的平均富集轮廓。（I）揭示核小体模式的D16+scATAC-Seq文库的插入大小度量直方图。 2? 识别具有不同重编程电位的异质性亚组 ? 为了确定每个重编程时间点存在的不同群体，使用参考成分分析对scRNA-Seq文库进行了聚类。BJ细胞与平滑肌谱系显著相关（图1A，1B）。D2细胞被4个不同的亚组（G1～G4）标记，其中G1-2细胞与成纤维细胞和间充质干细胞（MSCs）表现出较低的相关性（图2A）。另一方面，D8细胞分布在三个离散的亚组中。D8 G1细胞与成纤维细胞、平滑肌、肌细胞和MSC谱系相对应，而G3细胞与PS