miR-29amiR-30cDNMT3A轴表观遗传调控骨髓充质干细胞SOD2和线粒体氧化应激.docxVIP

miR-29a/miR-30c/DNMT3A轴表观遗传调控骨髓充质干细胞SOD2和线粒体氧化应激 导读 人骨髓间充质干细胞（hMSCs）是从健康捐献者的骨髓中提取的干细胞经体外培养后制备成干细胞药物，具有促进受损细胞再生、释放细胞因子、抑制炎症反应、促进血管再生等作用。然而，培养时间过长会导致细胞衰老，影响其增殖和治疗潜力，而活性氧(ROS)介导的氧化应激是细胞衰老的主要原因之一。 为了解miRNAs在调节骨髓基质干细胞细胞衰老中的作用，研究通过沉默DiGeorge综合征关键区8 (DGCR8)基因(miRNAs生物发生的重要组成部分)使hMSC中所有miRNAs沉默。DGCR8敲除的hMSCs表现出增殖缺陷和衰老变化。转录组分析显示，在DGCR8敲除的hMSCs中，抗氧化基因超氧化物歧化酶2 (SOD2)显著下调。并导致抗氧化基因SOD2上游CpG岛高度甲基化，且该过程受到表观遗传调节因子DNMT3A的调控。miR-29a-3p和miR-30c-5p通过直接抑制DNMT3A来调节hMSCs中SOD2的表达和氧化稳态，并挽救了增殖缺陷、线粒体功能障碍和早衰。该研究为miR-29a-3p/miR-30c-5p/DNMT3A/SOD2轴调控hMSCs衰老提供了新的见解。 结果 1?DGCR8缺失导致增殖缺陷并诱导衰老 为了确定在hMSCs体外扩增过程中miRNA的整体丢失的影响，研究通过siRNA转染敲除3~5代hMSCs的miRNA生物合成关键基因DGCR8，观察miRNA整体丧失对细胞生长的影响。与siGFP转染的对照细胞相比，siDGCR8转染的细胞表现出增殖损伤，倍增时间延长(图1A)。使用MTS法检测细胞活性，siDGCR8转染的hMSCs表现出严重的细胞增殖缺陷。BrdU掺入法分析证实，与对照细胞相比，DGCR8基因敲除细胞的增殖率显著降低(图1B)。 ? 由于增殖受阻是细胞衰老的标志，研究接下来通过测定β-半乳糖苷酶（SA-β-GAL）活性来研究DGCR8基因敲除对hMSCs衰老的影响。在转染siDGCR8的hMSCs中，SA-β-GAL的活性显著升高，且具有更高比例的SA-β-GAL阳性细胞(图1C)。此外，DGCR8缺失的hMSCs经历了类似衰老细胞的形态变化。 由于肿瘤抑制网络通常在细胞衰老过程中被激活，研究接下来检测了主要的肿瘤抑制基因表达。DGCR8基因敲除细胞显示出p53、p-p53(Ser15)和CDKN1A?(P21)?mRNA和蛋白水平升高(图1D)，并与复制性衰老（Replicative senescence）细胞的以上蛋白表达相当，此外p53靶基因抗氧化应激蛋白Sestrin1(SESN1)和GADD45(生长停滞和DNA损伤诱导基因45)的mRNA水平也显著升高。 ? 为了确定复制衰老细胞和DGCR8基因敲除细胞转录本的共同特征，研究对hMSCs多次传代的细胞（复制性衰老细胞）以及siGFP-和siDGCR8转染细胞的mRNA表达谱进行测定。正如预期，复制性衰老和DGCR8缺失的hMSCs在基因表达谱上都显示出明显的变化，比较复制性衰老（传代晚期vs传代早期）和DGCR8缺失的过早衰老（siDGCR8 vs. siGFP）的相关通路变化，发现传代晚期和siDGCR8 细胞的IL-8信号通路、衰老通路和磷脂酶C信号通路等经典通路均发生了上调(图1E)，且衰老相关分泌蛋白白细胞介素-8(IL-8/CXCL8)在DGCR8基因敲除细胞中显著上升(图1F)。总之，通过对DGCR8基因的敲除后引起的miRNA整体丢失，导致了hMSCs的提前衰老。 ? 图1.hMSCs中DGCR8的沉默导致严重的增殖缺陷和细胞衰老(A)转染siGFP (白点)或siDGCR8(黑点)的hMSCs生长曲线。(B)siRNA转染5d后，BrdU掺入进行定量分析。(C)衰老相关SA-β-GAL染色，与siGFP转染组相比，转染siDGCR8的人骨髓间充质干细胞SA-β-GAL阳性细胞数增加，体积增大(左)。转染siDGCR8的人骨髓间充质干细胞SA-β-GAL阳性细胞百分率明显高于对照组。(D)肿瘤抑制基因和衰老标志物p21、p53和p-p53(Ser15)的蛋白检测。(E)复制性衰老和DGCR8敲除细胞的典型通路的富集分析热图。(F)ELISA测定DGCR8基因敲除后IL-8的分泌水平 ? 2?DGCR8基因敲除导致ROS水平升高和RAS信号诱导 ? 活性氧(ROS)的产生和氧化应激是细胞衰老的主要原因。因此，研究者分析了miRNA的整体丢失对ROS水平的影响。使用ROS荧光探针H2DCF-DA分析发现，siDGCR8转染的hMSCs的ROS生成明显增加(图2A)。总ROS和H2O2的定量测量进一步证实了ROS的产生，在DG