转录组和差异分析研究雌性桡足类柱形宽水蚤存活率.docxVIP

转录组和差异分析研究雌性桡足类柱形宽 水蚤存活率 导读 背景：桡足纲动物是远洋食物的基本组成部分，但是关于其自然种群繁殖的分子基因报道仍然很少。作者通过转录组分析研究了地中海那不勒斯收集的雌性桡足类柱形宽水蚤，该物种在浮游动物中占主导地位。对连续几周收集的成年雌性进行了转录组测序和差异分析。作者旨在检测可能影响自然种群中桡足纲繁殖潜能且其表达可能受到浮游植物来源的脂环素影响的关键基因，脂氧化酶的相关产物会显著影响桡足纲幼虫的存活。 结果：采样日期的温度、盐度、pH和氧气都保持一致，同时观察浮游植物细胞浓度，脂蛋白浓度和硅藻细胞中脂蛋白含量的变化。5月23日，幼虫存活率为25%，5月23日为93%。转录组从头组装得到268665个转录本和120749个基因，其中50%具有注释功能。在两个采样日期差异表达的转录本共有331个，其中119条序列进行了功能注释。共有144个差异表达基因，注释了31个。大多数显著下调的基因是A5假定气味结合蛋白，其他差异表达基因与发育代谢过程，蛋白质泛素化和应激反应有关。采用qRT-PCR对转录组分析结果进行了验证。 实验设计 结果 1???环境、化学和生物变量 ? 关于非生物(温度、盐度、pH和氧气)、浮游植物和氧脂素在两个选定日期的变化的信息见表1。非生物变量在两个采样日期之间没有显示出很大的变化而浮游植物群落丰度和组成有更明显的变化。T检验的结果表明,使用早期数据评估幼虫存活率（25%和93%）见图1。 ? 表1.?非生物变量，浮游植物组成和氧脂素。2017年5月23日和30日在lelt - mc测量的环境变量、浮游植物丰度和组成、羟脂素浓度和羟脂素/硅藻细胞(羟脂素/硅藻细胞)含量。总体而言，5月23日浮游植物浓度(14.74 106 cells/L)低于5月30日(17.64 106 cells/L)。同样，5月23日(202.82ng/L)的羟脂素浓度也高于30日(173.47ng/L)。 ? 图1.桡足类柱形宽水蚤反应。在两个采样日期，测量了成年雌性的平均粪便颗粒和产卵量及平均卵孵化成功率。通过T检验分析差异。 ? 2 ??转录组从头组装和功能注释 ? 对两次采用的幼虫提取RNA，并进行建库测序。过滤后，共产生132Mreads。使用Trinity软件对测序数据进行了从头组装共得到268665条isoforms，包含120749个unigenes。对isoforms和unigenes进行了功能注释。 ? Blast2Go结果显示，大概10%的匹配unigenes与非冗余蛋白数据库中的相似序列具有很高的同源性。总体而言，超过42%的序列具有很高的同源性。Blast2Go注释结果显示，在62,648个unigenes中，有31,346个得到了功能注释(50.04%)。共有126358条GO terms分配到生物过程(BP, 36.77%),分子功能(MF, 35.57%)和细胞组件(CC、27.66%)中(图2)。大多数unigenes注释到代谢和细胞过程(29%)、绑定和催化活性(分别为32.55%和49.59)和细胞或细胞部分(20%)。 ? 图2.GO注释分析。共有3个GO大类分别为生物过程、分子功能和细胞组成。 ? 3 ??差异表达分析和转录组验证 ? 对5月30日和5月23日采集的样品进行表达水平的分析，共有144个差异表达基因。5月23日，有108个基因下调表达，36个基因上调表达。在144个差异表达基因中，有31个(6个上调，25个下调)进行了GO注释（表2）。 ? 表2.差异表达基因。 ? 为了进一步分析基因功能，作者对isoforms进行了差异表达分析。其中差异表达的isoforms共有331条，下调199条，上调132条。有119条序列进行了GO注释。总体来说，主要分为GO三大类其中BP和MF比例类似，CC比例较小（图3）。有趣的是，一些GO terms的isoforms在23日显著上调或下调（图3）。在BP子类中，参与ATP代谢，细胞通讯，细胞响应刺激，细胞定位的通路的isoforms下调表达。与此相反，参与分解代谢过程，细胞组分等过程的isoforms上调表达。 ? 图3?.差异表达isoforms的GO注释。GO功能三大类分别为生物过程（BP），分子功能（MF）和细胞组分（CC）。上调isoforms用蓝色表示，下调isoforms用红色表示。 ? 对5月23日和5月30日的unigenes和isoforms进行聚类分析见图4。5月23日，大多数显著下调的unigenes和isoforms被注释为A5假定的气味结合蛋白。其他下调的unigenes被注释为与发育代谢过程(涉及几丁质和胶原)、蛋白质泛素化、应激反应(主要是热休克蛋白70)、氧化还原反应和水解酶活性等功能。