基因文库的构建.pptxVIP

主要内容;DNA片段 的获得;;第一节 DNA基因文库;二、 DNA文库的构建;（一）、基因组DNA库 Question2：如何保证目标基因包含在所构建的文库中？ 考虑两个实际问题： 选择的载体装载量 所用的内切酶对基因组DNA的完全切割频率和不完全切割;人类基因组2.8X106Kb λ置换载体的平均置换片段20Kb 重组子的最小数目n＝1.4X105 考虑取样，酶切等原因，某些基因可能有多个重组子，而某些基因完全不包含。通过概率的统计，人类基因组中某个特异的片段有95％概率包含所需要的重组子为 n＝4.2X105 ;2、高容量载体构建基因组克隆 优点： A、所需要的重组子少（即文库中包含的克隆数目较少）。 B、目标基因相对比较完整。 ;第二节 亚克隆;第二节 亚克隆;通过作图标出一个DNA分子上的不同限制性位点。以λDNA为例;;按照诱变产生的不同效果分类： 随机诱变：在克隆化的基因序列中随机产生各种诱变。 化学诱变、盒式诱变、随机缺失诱变等 定点诱变：体外特异地改变目的DNA序列中某个碱基的技术称为定点诱变 PCR介导的定点诱变、寡核苷酸介导的诱变（如kunkel法）;第三节：克隆DNA序列的体外诱变;末端标记;一、缺失诱变 2、通过酶切图谱完成中间缺失;二、盒式突变 1、原理：利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段,取代野生型基因中的相应序列。 2、人工合成的突变序列的特征 由两条合成的寡核苷酸组成的,当它们退火时,会按设计要求产生出克隆需要的粘性末端, 由于不存在异源双链的中间体,因此重组质粒全部是突变体。;盒式突变举例1;;第三节：克隆DNA序列的体外诱变;三、定点诱变的PCR方法 根据靶DNA序列设计一对互补的内侧引物c和b’(c和b互补)，他们在相同的位点具有同样的碱基突变； 分别以左侧引物ac和右侧引物bd进行两轮PCR扩增； 除去未参入的多余引物，由于具有重叠序列，故经变性和退火形成异源双链分子 其中只有具3’凹陷末端的双链分子可通过TaqDNA聚合酶的及外侧引物a和d的作用下，形成其突变位点是位于靶DNA序列中但远离两端的突变体。 ;四、引物延伸：单引物法（不依赖PCR反应） 1、原理 利用一段人工合成的，与互补的序列有一个碱基错配的寡核苷酸片段（7~20碱基）, 并由该寡核苷酸引导DNA的体外合成。;A;;A;;五、寡核苷酸介导的定点诱变;（五）寡核苷酸介导的定点诱变;;;第四节 实例3:基因编码序列的丙氨酸扫描诱变;;;;;;按照诱变产生的不同效果分类： 随机诱变：在克隆化的基因序列中随机产生各种诱变。 化学诱变、盒式诱变、随机缺失诱变等 定点诱变：体外特异地改变目的DNA序列中某个碱基的技术称为定点诱变 PCR介导的定点诱变、寡核苷酸介导的诱变（如kunkel法）;二、盒式突变 1、原理：利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段,取代野生型基因中的相应序列。 2、人工合成的突变序列的特征 由两条合成的寡核苷酸组成的,当它们退火时,会按设计要求产生出克隆需要的粘性末端, 由于不存在异源双链的中间体,因此重组质粒全部是突变体。;二、盒式突变 1、原理：利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段,取代野生型基因中的相应序列。 2、人工合成的突变序列的特征 由两条合成的寡核苷酸组成的,当它们退火时,会按设计要求产生出克隆需要的粘性末端, 由于不存在异源双链的中间体,因此重组质粒全部是突变体。