基因文库与克隆分析应用新.pptxVIP

第九章 基因文库与克隆分析应用;克隆（重组技术）的基本步骤: ?目的基因的获取：供体生物基因或称外源基因的获取与纯化 ?载体的选择 ?限制性酶切：目的基因与载体形成粘性末端 ?纯化 ?连接：目的基因连接到载体中 ?转化：将这个重组DNA分子转入受体细胞 ?筛选和鉴定：对吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定 ?基因表达：进行培养，检测外源基因表达产物;复习;质粒的生物学基本特性： 自主复制性：携带有自己的复制起始区（ori），它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。 不相容性：不同质粒如果被导入同一细胞中，会彼此竞争，拷贝数多的复制更快，结果在细菌繁殖几代之后，子细胞中绝大多数都含有占优势的质粒，因而这两种质粒中只能有一种长期稳定地留在细胞中。 稳定性：质粒在宿主细胞中保持着一定的考贝数。 寄生性：质粒只能在宿主的细胞内复制。 表现型：不同的质粒有不同的表型，如对抗生素的抗性等。;（一）原核生物基因文库的构建 （二）真核生物目的基因的获得;二、目的基因的获得;二、目的基因的获得;c、蓝-白斑筛选 ? 如pUC质粒含LacZ基因（编码β半乳糖苷酶），该酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，称之为蓝-白斑筛选。;二、目的基因的获得;（二）真核生物目的基因的获得 1、cDNA文库的构建： (1)分离提取细胞总RNA (2)mRNA与其他RNA的分离，mRNA仅占总RNA的 1~2%，可利用mRNA poly(A)与其他RNA分开(p-108)。 (3)以mRNA为模板反转录合成cDNA的第一条链 ? mRNA纯化后，加入Oligo(dT)作为引物，引导 DNA链的合成， 同时加入逆转录酶和四种dNTP， 形成RNA-DNA杂合分子。;二、目的基因的获得;1．样品处理。组织：取 50-100 mg 组织（新鲜或 -70 ℃ 及液氮中保存的组织均可）置 1.5 mL离心管中，加入 1mL Trizol 充分匀浆，室温静置5 min (p-108)。 ;2 ．加入 0.2 mL 氯仿，振荡 15 s ，静置 2 min。 3 ． 4 ℃ 离心， 12000 g × 15 min ，取上清。 4 ．加入 0.5ml 异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置 10min。 5 ． 4 ℃ 离心， 12000 g × 10 min ，弃上清。 6 ．加入 1ml 75% 乙醇，轻轻洗涤沉淀。 4 ℃ ， 7500 g × 5 min ，弃上清。 7. 晾干，加入适量的 DEPC H2O 溶解（ 65 ℃ 促溶 10-15 min。;2、cDNA的扣除文库 ? 将两种不同组织来源的mRNA进行比较，用扣除杂交（subtractive hybridization)排除相同部分（即共同表达的那部分mRNA），选出有差异的、特异表达mRNA，构建成的cDNA文库。 扣除文库的构建过程 ? 从两种不同类型的细胞T、D分别提取mRNA ? T细胞mRNA逆转录合成单链的cDNA ? 向T细胞cDNA中过量加入D细胞总mRNA ? 两者有共同序列的mRNA和cDNA形成mRNA-cDNA杂合分子，余下单链cDNA代表了仅仅存在于T细胞表达的基因信息。 ? 羟基磷灰石层析柱（HAP)分离单、双链核酸 ? 分离得到的单链cDNA合成双链再构建成文库;二、目的基因的获得;PCR反应概述 PCR技术的创建 PCR的原理 PCR的反应体系和方法 PCR的类型和应用; 多聚酶链式反应概述 （PCR：Polymerase Chain Reaction）;PCR技术的创建;;PCR原理;PCR原理;;;94℃ 30s 55 ℃ 30s 72 ℃ 1min; 总体积 25-50-100 ?l Buffer 缓冲液 dNTP 底物 Primer（2） 引物 DNA分子 模板 Taq酶 DNA聚合酶 ;（1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100 ng DNA模板/100 ?L反应体系。 模板浓