重组DNA关键技术.docVIP

遗传工程也叫基因工程(gene engineering)基因操作(gene manipulation)或重组DNA技术(recombination DNA technique)是20世纪70年代以后兴起一门新技术其关键原理是用人工方法把生物遗传物质通常是脱氧核糖核酸(DNA)分离出来在体外进行基因切割连接重组转移和表示技术基因转移已经不再限于同一类物种之间动物植物和微生物之间全部可进行基因转移改变宿主遗传特征发明新品种系或新生物材料 基因工程是在分子水平上对基因进行操作复杂技术，通常包含4个步骤 :一是克隆目标基因，取得所需要·DNA特异片段;二是将目标基因和DNA载体连接成重组DNA;三是将重组DNA引入细菌或动植物细胞内使其增殖;四是将表示目标基因受体细胞挑选出来，使目标基因表示对应蛋白质或其它产物，从而育成动植物优良新品种(系)。 自1977年成功地用大肠杆菌生产出生长Itl释放抑制因子以来，人胰岛素、人生长激素、胸腺肽、干扰素、尿激酶、肿瘤坏死因子、疯牛病疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、甲型肝炎病毒疫苗、幼畜腹泻疫苗和青霉素酰化酶基因工程菌株等数十种基因工程产品相继问世。优质产毛羊等动物新品种，金色水稻，抗虫或抗除草剂玉米、大豆、棉花、水稻，转类胡萝卜素生物合成相关酶基因花卉、蔬菜等已获推广或已取得阶段性结果。 广义遗传工程包含细胞水平上遗传操作(细胞工程)和分子水平上遗传操作，即重组DNA技术(有些人称之为基因工程)。狭义遗传工程则专指后者。 简史 重组DNA技术起源于两个方面基础理论研究--限制性核酸内切酶(简称限制酶)和基因载体(简称载体)。限制酶研究能够追溯到1952年美国分子遗传学家S.E.卢里亚在大肠杆菌中所发觉一个所谓限制现象--从菌株甲细菌所释放噬菌体能有效地感染同 重组DNA技术 重组DNA技术 一菌株细菌，可是不能有效地感染菌株乙;少数被感染菌株乙细菌所释放同一噬菌体能有效地感染菌株乙可是不能有效地感染菌株甲。经过长久研究，美国学者W.阿尔伯在1974年底于对这一现象提出了解释，认为经过噬菌体感染而进入细菌细胞DNA分子能被细菌识别而分解，细菌本身DNA则因为已被自己所修饰(甲基化)而免于被分解。但有少数噬菌体在没有被分解以前已被修饰了，这些噬菌体经释放后便能有效地感染同一菌株细菌。被甲(或乙)这一菌株所修饰噬菌体只能有效地感染甲(或乙)，而不能有效地感染乙(或甲)，说明各个菌株对于外来DNA限制作用常常是专一性。经过深入研究发觉这种限制现象是因为细菌细胞中含有专一性限制性核酸内切酶缘故。 重组DNA技术中所用载体关键是质粒和温和噬菌体(见转导)两类，而在实际应用中载体几乎全部是经过改造质粒或温和噬菌体。英国微生物遗传学家W.海斯和美国微生物遗传学家J.莱德伯格等在1952年首先认识到大肠杆菌F因子(见细菌接合)是染色体外遗传因子。1953年法国学者P.弗雷德里克等发觉大肠杆菌产生大肠杆菌素这一性状为一个染色体外大肠杆菌素因子所控制。1957年日本学者发觉了抗药性质粒。后两类质粒全部是在遗传工程中广泛应用质粒。 重组DNA技术中广泛应用噬菌体是大肠杆菌温和噬菌体λ，它是在1951年由美国学者E.莱德伯格等发觉。 到70年代初，生物化学研究进展也为重组DNA技术奠定了基??972年美国分子生物学家P.伯格等将动物病毒SV40DNA和噬菌体P22DNA连接在一起，组成了第一批重组体DNA分子。1973年美国分子生物学家S.N.科恩等又将多个不一样外源DNA插入质粒pSC101DNA中，并深入将它们引入大肠杆菌中，从而开创了遗传工程研究。 步骤和方法 折叠步骤 ?重组DNA技术通常包含四步:①取得目标基因;②和克隆载体连接，形成新重组DNA分子;③用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传;④对转化子筛选和判定。;⑤对取得外源基因细胞或生物体经过培养，取得所需遗传性状或表示出所需要产物。在具体工作中选择哪条技术路线关键取决于基因起源、基因本身性质和该项遗传工程目标。 折叠方法 重组DNA片段取得关键方法有: ①利用限制酶取得含有粘性末端或平整末端DNA片段; ②用机械方法剪切取得含有平整末端DNA片段，比如用超声波断裂双链DNA分子; ③经反向转录酶作用从mRNA取得和mRNA次序互补DNA单链，然后再复制形成双链DNA(cDNA)。比如人胰岛素和血红蛋白结构基因全部用这方法取得。这么取得基因含有编码蛋白质全部核苷酸次序，但往往和原来位置在染色体上基因在结构上有区分，它们不含有称为内含子不编码蛋白质间隔次序(见基因); ④用化学方法合成DNA片段。从蛋白质肽链氨基酸次序能够知道它遗传密码。依据这密码用化学方法能够人工合成基因。 重组DNA技术技术路线 重组DNA技术技术路线 DNA片段和载体连接