WB实验步骤详解必威体育精装版.pdfVIP

Western 实验步骤 Western ，也称Western blot 、Western blotting 、Western 印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。 Western 可以参考如下步骤进行操作。 1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation) 可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western 及IP 细胞裂解液(P0013)、RIPA 裂解液等，裂解贴 壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体 蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细 胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028) 。 收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使 用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和 还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生产的Western 及IP 细胞裂解液或RIPA 裂解液，可以使用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0011/P0012) 。 2. 电泳(Electrophoresis) (1) SDS凝胶配制 SDS凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS凝胶配制试剂 盒(P0012A) 。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS的配方。 (2) 样品处理 在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS蛋白上样缓冲液。例 2X 或5X 的SDS蛋白上 样缓冲液。使用5X 的SDS蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更 多的蛋白样品。5X 的SDS蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的 SDS蛋白上样缓冲液(5X)(P0015) 。 100℃或沸水浴加热3-5 分钟，以充分变性蛋白。 (3) 上样与电泳 冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS胶加样孔内即可。 为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准(P0066) 。 电泳时电泳液可以使用碧云天生产的SDS电泳液(P0014A/P0014B) 。 电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于 Bio-Rad 的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V 左右。 SDS可以采用普通的电泳仪就可以满足要求，也可以采用碧云天的多功能电泳仪(带定时)(EEP102) 。 为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定 时时间为90 －120 分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况， 预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。 3. 转膜(Transfer) 我们推荐在Western 实验中选用PVDF 膜(FFP30/FFP33) 。硝酸纤维素膜(NC 膜)(FFN06/FFN09)也可以使 用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商 的推荐使用步骤。 通常如果使用Bio-Rad 的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60 分钟。 也可以在15-20mA 转膜过夜。转膜时也可以使用碧云天的多功能电泳仪(带定时)(EEP102) 。具体的转膜时 间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小， 需要的转膜时间越短。 在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中 进行转膜。 转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2 条带较难全部转到膜上。 转膜的效果也可以用丽春红染色液(P0022)对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝 快速染色液(P0017)对完成转膜的SDS胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。 4. 封闭(Blocking) 转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western 洗涤液(P0023C) 中，漂洗1-2 分钟，以洗去膜 上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。 用微型台式真空泵(EVAC06/EVAC07)或滴管等