华南农业大大学LDH同工酶圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳.pptVIP

实验四 LDH同工酶圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳  一、实验目的 ·1.了解聚丙烯酰胺凝胶的制作过程及结构特点。 ·2.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及分离乳酸脱 氢酶同工酶的电泳过程。  二、实验原理 聚丙烯酰胺凝胶原理及影响因素(同实 验三) 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳原理(同实验三)  ·3.乳酸脱氢酶(LDH同工酶圆盘电泳 ·同工酶是指生物体中结构和性质不同而能催化相 同反应的一类酶。许多酶都具有同工酶(约占已 知酶的40~50%),凝胶电泳可利用同工酶结构 上的差异而将之分离。  乳酸脱氢酶( lactate dehydrogenase简称LD, EC.1.1.1.27)是催化丙酮酸和乳酸可逆转化的 酶 1959年 Markert等用电泳的方法将牛心肌提纯 的LD结晶分离出5条区带,靠近阳极一端的称 LDH,靠近阴极一端的称为LDH5;其余3种,由 阳极到阴极依次命名为LDH2,LDHB及LDH4。它 们均具有LD催化活性,从而首先提出了同工酶 ( l coenzyme)的概念。 目前已知LDH同工酶是由亚基及M亚基按不同比例 组成的四聚体,它们是H4(LDH),H3M (LDH2 ), H2M2(LDH3), HM3(LDH4) KM4 LDH5)5种。心肌中以LDH含量高,骨骼肌及 肝中LD5含量高。  LDH同工酶底物染色显色反应如下: 乳酸 NAD PMSH NBT(无色) LDH 丙酮酸 NADH(H) PMS NBTH2(蓝紫色甲膝 反应式中PMS为甲硫吩嗪( phenazine methosulfate), NBT为氯化硝基四氮唑蓝( nitroblue tetrazolium chloride)的缩写,它们都是接受电子的染料。LDH与底 物染色液在37℃温浴中脱下的氢最后传递给NBT生成蓝紫 色的NBTH2称为甲膝,此物不溶于水,有利于显色后区带 的保存,但可溶于氯仿及95%乙醇(9:1)的混合液。因 此电泳后的显色区带可通过浸泡法浸出,于560m比色 也可用光吸收扫描仪得出LD同工酶间的相对百分含量。  LDH(H:)880 LDH,(H,M)e LDH3 (H,) LDH4(HM3)一 LDHS(M)- 心肌肾肝骨骼肌血清 ⊙原点 目前,LDH及同工酶检测已广泛用于临床,作为某些疾病 鉴别诊断的依据,常用醋酸纤维薄膜电泳,琼脂糖电泳及 聚丙稀酰胺凝胶电泳分离LD及共同工酶,这3种不同支 持物电泳及染色原理完全相同,但灵敏度不同。  三、实验材料、仪器和试剂 °(-)实验材料(由老师准备) 兔子血清和组织(肝脏组织、心脏组织、肾脏组 织、肌肉组织、肺等)提取液(组织重量与组织 匀浆缓冲液体积比为1:10(g/mL) 组织样品处理:称取0.5克兔血清和肝脏等组织, 各加入5 mLPBS和少量石英沙于研钵磨成匀浆,离 心10000/10~15min,取上层清液4℃保存作 为母液。 电泳样品:用移液枪各取lmL上述提取液,加 lmL40%蔗糖溶液和20uL溴酚兰,混匀。  °(二)仪器及器皿 全班共用: ·圆盘电泳槽直流稳压电电泳仪恒温水浴锅 微量加样器移样器电炉等 ·电泳槽3个(12个管/个),电泳仪3个,200m烧杯 10个,100m容量瓶5个,1000mL容量瓶1个(或 1000mL量筒1个),广泛p试纸,塑料大烧杯(2L 2个,塑料大烧杯(L)1个,剪细滤纸条1杯 2每组配备 长滴管1支,玻管及乳胶管(带玻珠)2个,长针 头注射器1支,试管2支,洗耳球1个,10m离心 管2个,玻棒。  (三)、试剂 1制备样品有关试剂(老师配) (1)0.0lmol/Lpl6.5磷酸盐缓冲液(PBS), 用于组织匀浆缓冲液及LDH的染色液 Na2HPO4·12H200.2256g,NaH2PO4·H20 0.2137g,加水定容到200m (2)40%蔗糖溶液20g蔗糖用水溶解定容至50mL。 (3)0.5%溴酚兰10m