毕赤酵母的基因表达及其初步纯化 课件.pptVIP

4A β 15 基因在毕赤氏酵母中的分泌表达 及 初步纯化 —— Alade 毕赤氏酵母作为表达载体的优点 1 、表达效率高，遗传稳定性好 2 、结构简单，表达调控机理比较清楚 3 、有 Pr 加工系统 4 、培养简单，成本低廉 5 、表达产物可分泌至培养基中而自身蛋白的 分泌却很少，利于下游的纯化 （毕赤氏酵母是近年来广泛应用的真核表达 系统。） 一、实验材料 ? DH5 α 、 pPICZ α A 、 GS115 、 TOP10 、， pQE4A β 15 ? pMD18T 载体、 Pfu 高保真酶、 T4DNA 连接 酶、限制性内切酶 . PCR 产物纯化试剂盒、 质粒提取试剂盒、羊抗鼠 IgG -HRP 、增强 型 HRP-DAB 、底物显色试剂盒 . 基因在毕赤氏酵母中表达的简单过程 4A β 15 基因的获取 (PCR) ↓ 目的基因的修饰与克隆 ↓ 表达载体的构建 ↓ 毕赤氏酵母的线性化、电转化与鉴定 ↓ 目的基因在毕赤酵母 GS115 中的表达 ↓ 重组蛋白的鉴定与分析 ↓ 重组 4A 15 的初步纯化 1 、目的基因 4A β 15 获取 PCR ? 在设计 N 端引物时引入 Xho Ⅰ酶切位点及 Kex2 信号肽水解位点，并删除 Kex2 后面 的 Ste3 位点（ Glu-Ala-Glu-Ala ） ? 在下游引物（ 5 GC TCT AGA TTG ATG ATG AACTTC ATA 3 ） 引入终止密码子和 Xba Ⅰ酶切位点， 目的基因 4A β 15 获取 PCR ? 以 pQE4A β 15 为模板，进行 PCR 扩增， ? 扩增条件为 94 ℃ 3 min ， 94 ℃ 30 s ， 57 ℃ 30 s ， 72 ℃ 50 s ， 35 个循环， 72 ℃延伸 10 min ， 4 ℃保存 . ? 1.5% 琼脂糖分析 PCR 产物 2 、目的基因的修饰与克隆 ? PCR 扩增产物回收后 + 克隆载体 pMD18T ? 以 1 ： 3 （ V ）的比例通过 T4 连接酶接， ? 连接产物转入 大肠杆菌 DH5 α ，菌落 PCR 。 ? 分析阳性菌落：挑取 4 个阳性菌落 进行序 列分析 . 序列正确的命名为 p4A β 15 3 、表达载体的构建 ? 双酶切基因片段 p4A β 15 ，用试剂盒回收， 双酶切质质粒 pPICZaA ，回收大片段， ? 定向连接，连接产物在低盐的 LB 平板上培 养。 ? 挑取抗性菌落提取质粒，进行双酶切鉴定。 5 、毕赤氏酵母 GS115 的电转化与鉴定 —— 5.1 电转化 ? 1 、 线性化 —— 限制性内切酶 B st XI 单酶切 表达载体和重组质粒 ? 2 、电转化 —— 电激转化毕赤酵母 GSll5 感 受态细胞（转化条件：电压 1 500 V ， 4 ms ） . 电转化完成后培养 ? 转化物涂布于 Zeocin 100 mg /L 的 YPD 平 板上， 28 ℃恒温培养 36 h 左右，抗性平板 上生长的菌落相应的命名 GS115/pPICZaA 和 GS115/pPICZa4A β 15 . 5 、毕赤氏酵母 GS115 的电转化与鉴定 —— 5.2 转化子的鉴定 ? 提取抗性菌落的基因组 DNA,( 方法参见 Invitrogen 酵母手册 ). 以此基因组 DNA 为 模板， pPICZaA 5 Aox1 primer 和 3 Aox1 primer 为引物进行 PCR. ? 1.5% 的琼脂糖凝胶电泳分析 6 、目的基因在毕赤酵母 GS115 中表达 ? 挑阳性克隆单菌落接种于 BMGY( 含酵母粉、 甘油、生物素 …… ）的培养基上摇床培养 （ 28 ℃， 250 r /min 培养至 OD 600 为 2~6 ） ? 离心收集菌体，用 BMMY 重悬，至 OD 600 ≈ 1 继续摇床。 . ? 每 24 h 向培养基中添加 无水甲 醇（诱导表 达产物分泌到培养基中） 至终浓度为 1% ； 每 24 h 取样，离心收集上清液，上清液用 丙酮沉淀后进行 12%SDS分析 . 对 GS115 和 GS115 /pPICZaA 作同样的处理， 以便于下游 SDS PAGE 的分析 6 、重组蛋白的鉴定与分析 —— 6.1 Western blo