植物细胞工程课件第五章细胞融合电子教案.pptVIP

细胞融合Cell Fusion;细胞融合的概念与意义; ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ;细胞接触;对称杂种 （symmetric hybrid）;用于细胞核或细胞质失活的方法分为物理和化学两大类： 物理方法常采用射线处理，如X射线、r射线等，它们能使细胞核失活； 化学处理目前常用的试剂有： 核失活－碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(IA)； 质失活－罗丹明（R-6-G）。R-6-G是一种亲脂染料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程而达到失活作用。;对称杂种：亲本双方原生质体完全融合在一起，相互之间未发生排斥，杂种的体细胞染色体数目为双亲之和，其外部形态呈中间类型。 结果在导入有用基因的同时，也带入了亲本的全部不利基因（或性状），一个杂种中有两套不尽相关的基因并不是试验所期望的，这样常导致部分或完全不育，因而难以形成育种上的有用材料。;不对称杂种：亲本双方原生质体发生部分融合，或发生了融合，但融合体在分裂过程中一方的部分核或质被排斥，因而其体细胞染色体数目达不到双亲之和。其外部形态呈双亲的中间型或偏一方形态，一般表现为雄性器官退化，正常花粉粒极少，育性低。 胞质杂种：携带一个亲本的核和两个亲本的细胞质。;细胞融合的意义; 第一个体细胞杂种 (Carlson，1972);据不完全统计，通过体细胞杂交至少已获得44个种内，103个同属异种， 48个属间，5个科间的细胞杂种，其中非对称融合的体细胞杂种在90%以上。（李杰等，2003） ;1980年，Butenko、Kuchko获得抗Y病毒的马铃薯杂种植株。;用于单克隆抗体、核酸疫苗制备，为大规模生产特定生物制品培育种子细胞。 动物个体克隆，培育动物新品种，使牲畜迅速实现良种化。 在基础理论研究上 — 动物细胞融合技术对研究细胞分化、基因定位、肿瘤发生机制与诊治等方面都有重要意义。;The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1984 for the discovery of the principle for production of monoclonal antibodies;;;;5.2 融合细胞的制备;5.2.1 植物原生质体的制备; 亚原生质体(subprotoplast) 核质体(nuclearplast) ? 胞质体（cytoplast）;原生质体的分离;用于分离原生质体的材料准备; 预处理及酶解; 酶的种类; 溶剂：原生质体培养基或特殊配制。 渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。 ; 酶处理 ;;原生质体游离; 沉淀法;采用漂浮法分离形成的原生质体带;0.6ml;以柑桔为例;果胶酶 纤维素酶; 原生质体活力测定;FDA（二乙酸荧光素）法 机理？ ;;5.2.2 动物单细胞的制备;自发融合 诱发融合;5.3.1 生物融合法-----仙台病毒法;1958年，日本学者冈田善雄（Okada）发现了HVJ病毒可促进细胞融合。 仙台病毒（HVJ）毒力低，对人的危害小 易被紫外线或β－丙炔内酯所灭活;诱导细胞融合的不是仙台病毒内部的 RNA，而是它的外膜。;不同细胞融合速度不同，快的370C中5min即可。; 融合成本低，勿需特殊设备； 融合子产生的异核率较高； 融合过程不受物种限制。 ;桥梁; 融合液：CaCl2 2H2O 8~10mmol KH2PO4 0.7mmol 甘露醇或山梨醇 0.5~1.0mol pH 5.6 ;P1;洋葱根尖原生质体（40×） ;烟草叶肉细胞和洋葱根尖细胞原生质体融合;PEG融合的 影响因素;　电融合法（electrofusion technique）是20世纪80年代发展起来的细胞融合技术，以电降解及双向电泳的联合作用为基础。; 电融合过程的分子机制;+;烟草原生质体（40×）;原生质体融合; 电融合仪的结构特点 交变电场部分 高频直流电击部分;电融合的 影响因素 ;电融合法的优点：;其他方法;5.4 融合细胞的选择与鉴定;5.4.1 动物融合细胞的选择培养技术;次黄嘌呤鸟嘌呤核糖磷酸转移酶缺失型细胞株;次黄嘌呤胸腺嘧啶核糖磷酸转移酶缺失型细胞株;植物体细胞杂交过程示意图;;杂种细胞选择系统;形态特征选择（morphology trait selecti