细胞培养(hela, 293,239T等细胞的培养).docVIP

Hela细胞传代培养操作步骤 1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。观察时拧紧盖子。 2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。 3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。取小 离心管一个，置于架子上。 4．取尖 吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。放置的方式，注意 吸管、吸量管前端都不要与架子接触。 5．取待传代的细胞。打开versene，用酒精灯外焰烧。烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。 6．用吸量管吸取旧的培养基，置 离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。（加versene主要是为了将旧培养基洗去）。在离心管中间部分将液体加入。吸液体和加液体时都不要对着细胞。 7．打开胰酶，然后将versene弃掉。换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。 8．将细胞放入37度孵箱。放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。别忘了用旧培养基中和。 9．取细胞，镜下观察消化情况。消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被 血清中和。然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。 10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。 11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。 12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。不要把枪伸到离心管内。 13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。镜下观察，摇匀，放入37度孵育。收超净台。 293T细胞? 培养条件：37℃，5%?CO2，PH值7.2~7.4，无菌恒温培养。? 细胞相关操作： 细胞复苏 1.?37°C水浴预热培养基（DMEM+10%?FBS）；2.?从液氮中取出细胞迅速放入37°C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）；3.?在超净台中加入5ml培养基重悬细胞，1000rpm离心5min；4.?弃上清，加入5ml培养基重悬细胞后转入T25培养瓶中，轻轻晃匀；5.?置于37°C，5%?CO2培养箱中培养(培养瓶盖没有透气孔的话,瓶盖不要拧太紧)； 6.第二天，用新鲜的培养基给细胞换液后继续培养。 细胞传代 1.?当细胞融合度达到90%以上时，给细胞传代； 2.?37°C水浴预热培养基（DMEM+10%?FBS）； 3.?在超净台中，弃培养基，加入2-5mlPBS清洗细胞后，再加入1ml胰酶消化细胞； 4.?显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，加入5ml培养基（DMEM+10%?FBS）终止消化； 5.用移液器轻轻吹下瓶壁上剩余的细胞，并轻轻吹打将细胞吹散； 6.将细胞移入离心管中，1000rpm离心5min； 7.弃上清，加入15-20ml的培养基（含血清）重悬细胞后转入T75培养瓶中或按适当比例传到T25瓶中（确保细胞贴壁后融合度在25-50%之间），细胞密度在1×104?cells/cm2?(2.5×105?cells/T-25瓶），混匀细胞悬液，确保细胞均匀分布； 8.将培养瓶置于37°C，5%?CO2的无菌培养箱中培养。 细胞冻存 1.37°C水浴预热培养基（DMEM+10%?FBS）； 2.消化细胞后给细胞计数: 1)洗净晾干血小板计数板和盖玻片，将盖玻片完全覆盖计数区； 2)充分混匀细胞，取少量(0.1-0.5ml)细胞悬液与等体积的染色液台盼蓝混合，移液器吹吸混合均匀，用移液器取20ul混合液从盖玻片两端(与中间凹槽平行的两端)分别打入细胞，以细胞悬液刚好浸湿盖玻片为佳； 3)显微镜下，数四个计数区的总细胞数，无活性细胞染成蓝色，活细胞不被染色； 4)细胞密度=细胞总数/4×10000×2； 这里10000是不变的，因为计数的细胞是在体积为1mm×1mm×0.1mm即10-4cm3计数池内，1cm3=1ml，将四个计数区的细胞数除以4取平均数，乘2是补偿加等体积台盼蓝形成的稀释。 5)细胞活性=活细胞数/细胞总数×100%。 注:细胞密度高时，可调整细胞悬液和台盼蓝的比例，计数时乘以相应的稀释倍数即可。 3.当细胞密度达到传代密度且细胞活性在90%以上时，可以冻存细胞。 4.在超净台中将要冻存的细胞移入离心管，1000rpm离心5min。 5.弃上清，用90%培养液+10