分子生物学常用技术PPT课件2.pptx

分子生物学常用技术第一节分子印迹与杂交技术Molecular Blotting Hybridization Technology学习要求：　熟悉分子印迹与杂交技术基本原理、类型及应用。 一、核酸分子印迹与杂交技术学习要求 1印迹(blotting) 指利用各种物理方法，使电泳凝胶中的生物大分子转移到硝基纤维膜等特定的支持物上，使之成为固相化分子的过程。核酸分子杂交(nucleic acid hybridization) 指具有一定互补序列、不同来源的核苷酸单链，在一定条件下按照碱基互补配对的原则形成双链的过程。(heteroduplex)探针(probe) 指可用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的,与被测序列互补并加有特殊标记物的DNA或RNA片段。非放射性标记物1非放射性标记物2dUTPDig-dUTP(地高辛-dUTP)Biotin-dUTP(生物素-dUTP)Dig-dUTPUU 用一种标记核苷酸代替原料dNTPs中对应的非标记核苷酸，使标记核苷酸掺入到新合成DNA链中。Dig-DNA探针杂交化学发光信号检测原理地高辛地高辛抗体-辣根过氧化物酶(Dig-HRP) Luminol化学发光原理 辣根过氧化物酶Biotin-DNA探针杂交化学发光信号检测原理生物素亲和素-辣根过氧化物酶(Biotin-HRP) Luminol化学发光原理 辣根过氧化物酶 （一）Southern印迹杂交 Southern印迹(Southern blotting)杂交是指DNA的印迹和DNA与DNA分子之间的杂交。 可用于基因组DNA的定性与定量分析，重组质粒和噬菌体的分析等。基本过程: 将琼脂糖凝胶电泳分离的待测DNA片段变性，再将凝胶中的DNA分子转移到硝基纤维膜等固相支持物上，然后用标记的探针检测待测的DNA。 Southern印迹杂交的基本步骤: ① 待测DNA样品的限制性内切酶消化 ② 酶切DNA样品的电泳分离 ③ 凝胶中DNA的变性和Southern印迹 ④ 探针的制备 ⑤ Southern杂交 ⑥ 杂交结果的检测 500g限制性内切酶消化酶切DNA样品的电泳分离凝胶中DNA带被转移到NC膜上重物Southern印迹凝胶中DNA分离带转移缓冲液玻璃板纸巾凝胶中DNA的NaOH变性Whatman滤纸NC膜或尼龙膜凝胶Whatman滤纸标记探针杂交探针杂交带曝光显影支持物 （二）Northern印迹杂交 利用类似于Southern印迹杂交的技术来检测RNA称为Northern印迹杂交（Northern blotting）。 原理和过程与Southern印迹基本相同，只是检测的分子是RNA，可用来对组织或细胞中的mRNA进行定性或定量分析。 Northern 与Southern blotting的异同点相同点：原理均为毛细作用 转移的是RNA转移前无需酶切转移效率较高变性方法: DNA(碱变性） RNA（甲醛、乙二醛等）不同点：用 途：检测组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平；比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。HRPHRPHRP North-South 杂交原理和操作流程(地高辛标记)⑤底物与抗体-HRP/AP反应, 显色或发光④HRP/AP标记抗体与Dig结合Y底物③杂交：Dig标记的探针与靶DNA结合 用无关的单链DNA，如小牛胸腺DNA或鲑鱼精子DNA预杂交。DD││① 电泳,转膜，紫外交联固定②漂洗和封闭 North-South 杂交原理和操作流程(Biotin标记)⑤底物在HRP催化下,反应发光底物④HRP标记的链亲和素与探针上的生物素结合③杂交：生物素标记探针与靶DNA结合HRPSABB││①电泳,转膜，紫外交联固定②漂洗和封闭后继的化学发光检测1.曝光：用滤纸吸去杂交膜上多余底物，作好标记， 保鲜膜包裹，放在暗夹里，放上X光片，曝光1-5 分钟；2.显影：取出X光片，按使用说明书显影和定影。 Luminol化学发光原理 （三）其他核酸杂交方法1.斑点印迹杂交 将变性的DNA或RNA直接点样于NC膜或尼龙膜上，故称为斑点印迹。简便、快速，可以在同一张膜上进行多个样品的检测。2.原位杂交(in situ hybridization) 是指直接用组织切片或细胞涂片进行杂交的方法，可用于检测组织切片或细胞内某些特异性核苷酸或核酸片段。96孔斑点印迹转印系统 二、蛋白质印迹技术(Western blotting) 根据蛋白质分子之间存在相互作用的特点，将蛋白质电泳分离，然后将其转移和固定于固体支持物（NC膜或其它膜）上，再用相应的蛋白质分子（最常用的是抗体）对其进行检测。　又被称为免疫印迹（immunoblotting）技术。 用于样品中特异蛋白质的检测 用于细胞中特异蛋白质的定量分析 用于蛋白质分子的相互作用研