哺乳动物基因工程PPT课件2.pptx

哺乳动物基因工程8 哺乳动物基因工程A高等哺乳动物基因工程的基本概念B高等哺乳动物的受体系统C高等哺乳动物的载体系统D高等哺乳动物的基因转移E利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白8 哺乳动物基因工程A高等哺乳动物基因工程的基本概念高等哺乳动物基因工程高等哺乳动物转基因技术高等哺乳动物细胞基因表达技术转基因动物个体动物工程细胞哺乳动物遗传性状改良蛋白多肽物质大规模生产药物筛选研究评价模型药物筛选研究评价模型人体基因治疗8 哺乳动物基因工程B高等哺乳动物的受体系统高等哺乳动物细胞的生长特性高等哺乳动物受体细胞的条件高等哺乳动物受体细胞的遗传标记常用的高等哺乳动物受体细胞高等哺乳动物细胞的生长特性正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征： 锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂 血清依赖性：细胞必须具有生长因子才能生长 接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制 形态依赖性：细胞称扁平状，并有长纤维网状结构上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中，一般只能存活50代且在培养皿上以平面的形式生长，即单层细胞生长。有时，正常细胞会改变某些特征而越过生理临界点，继续增殖并无限制分裂，这种状态称为细胞系形成，此时的细胞成为细胞系。高等哺乳动物受体细胞的条件以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具备下列条件 细胞系特征 丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征，便于大 规模培养 遗传稳定性 外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期保存 合适的标记 便于转化株的筛选和维持 生长快且齐 分裂周期短，生长均一，便于控制 安全性能好 不合成分泌致病物质，不致癌大多数正常的高等哺乳动物细胞并不能同时具备上述条件，癌细胞能满足上述前四项要求，但在安全性能上有欠缺。高等哺乳动物受体细胞的遗传标记营养缺陷型的哺乳动物受体细胞嘌呤核苷酸生物合成途径嘧啶核苷酸生物合成途径5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）从头合成途径氨基喋呤（AP）尿嘧啶核苷一磷酸（UMP）氨基喋呤（AP）GMP次黄嘌呤核苷一磷酸（HMP）AMP胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP）次黄嘌呤磷酸核糖转移酶胸腺嘧啶核苷激酶（HPRT）（TK）补救合成途径次黄嘌呤核苷（HR）胸腺嘧啶核苷（TR）高等哺乳动物受体细胞的遗传标记营养缺陷型的哺乳动物受体细胞含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）编码基因缺陷的受体细胞（tk -）不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因tk能与之遗传互补含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）编码基因缺陷的受体细胞（hprt -）不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因hprt与之遗传互补高等哺乳动物受体细胞的遗传标记哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记遗传标记编码产物筛选药物作用机理APH- 氨基糖苷磷酸转移酶G418 APH灭活G418DHFR 二氢叶酸还原酶氨甲喋呤 DHFR变体抗氨甲喋呤 HPH- 潮霉素B磷酸转移酶潮霉素B HPH灭活潮霉素B TK- 胸腺嘧啶核苷激酶氨基喋呤 TK合成TMPXGPRT- 黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶霉酚酸 XGPRT合成GMPADA- 腺嘌呤核苷脱氨酶腺嘌呤木酮糖苷 ADA灭活Xyl-A 常用的高等哺乳动物受体细胞 迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规模生产的高等哺乳动物受体细胞主要还是中国仓鼠卵巢细胞（CHO），其优势有如下几个方面：遗传背景清楚，生理代谢稳定与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确基因转移和载体表达系统完善耐受剪切力，便于大规模培养被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞（GRAS）8 哺乳动物基因工程C高等哺乳动物的载体系统人腺病毒DNA猴空泡病毒DNA（SV40）人乳多瘤病毒DNA（BKV）人牛痘病毒DNA人腺病毒DNA腺病毒的生物学特性 腺病毒科为线状双链DNA病毒，无包膜，呈二十面体，共有93个成员，分哺乳动物腺病毒和禽腺病毒两个属。目前已鉴定的人腺病毒有6个亚属，其中常用来构建载体的主要是C亚属的2型（Ad2）和5型（Ad5）病毒。 腺病毒感染人细胞时呈裂解型，不致癌；但对啮齿目动物来说，绝大多数的腺病毒成员均能致癌。人腺病毒DNA腺病毒的基因组DNAIVa2VAL1L2L3L4L5ITRITRE1E2E3E4 腺病毒基因组DNA全长36 kb，其包装上限为原基因组的105%， DNA两端各有一个反向重复序列（ITR）；E1-E4为早期基因，与病毒基因组的复制及晚期基因的表达调控有关，其中E3编码晚期基因的调控因子， L1-L5为编码病毒包装蛋白的晚期基因；IVa2和VA均为病毒RNA聚合酶的亚基编码基因。E3区缺失只会影响病毒颗粒的成熟，不影响基因组的复制功能，因而在构建载体时往往除去