核酸的性质及研究方法.pdfVIP

第七章 核酸的性质 及研究方法 提要 一、核酸的理化性质 二、核酸研究的技术和方法 1. 核酸的化学合成 2. 核酸的分离、纯化和定量 三、核酸一级结构的测定 1. DNA一级结构的测定 2. RNA一级结构的测定 核酸的理化性质 1. 紫外吸收 2. 酸碱解离 3. 变性 4. 复性和杂交 DNA的变性和复性 变性  定义：是指核酸受到加热、极端的pH或离子强度降 低等因素或特殊的化学试剂的作用，其双螺旋区的 氢键断裂，变成单链的过程。其中并不涉及共价键 断裂。  表征：核酸在变性时，紫外吸收和浮力密度升高， 黏度降低，生物活性（主要是RNA ）不变、降低或 丧失，其中紫外吸收增加的现象称为增色效应。  Tm ：双链DNA热变性是在很窄的温度内发生的，与 晶体在熔点时突然熔化的情形相似，因此DNA也具 有“熔点”，用Tm表示。Tm实际是DNA的双螺旋 有一半发生热变性时相应的温度。  DNA的Tm值受到DNA的均一性、G-C含量、离子强 度和特殊的化学试剂的影响。 GC含量对DNA Tm的影响 DNA分子中的GC含量与DNA Tm之间的关系曲线 复性  核酸变性在一定条件下也是可逆的。当各种变性因素 不复存在的时候，变性时解开的互补单链全部或部分 恢复到天然双螺旋结构的现象称为复性。热变性DNA 一般经缓慢冷却后即可复性，此过程被称为退火。  伴随着DNA复性的是其浮力密度和紫外吸收的减少、 粘度的增加和生物活性的恢复，其中紫外吸收减少的 现象被称为减色效应。  影响DNA复性的因素有温度、离子强度、DNA 浓度和 DNA序列的复杂度等。 DNA的复性历程 不同DNA的复性动力学曲线 核酸的水解 （1）酸水解 核酸分子内的糖苷键和磷酸二酯键对酸的敏感性不 同：糖苷键＞磷酸酯键；而嘌呤糖苷键＞嘧啶糖苷 键 （2）碱水解 RNA的磷酸二酯键对碱异常敏感，得到2′-或3′-核苷 酸的混合物；DNA对碱的作用并不敏感，其抗碱水 解的生理意义在于作为遗传物质的DNA应更稳定， 不易水解。而RNA （主要是mRNA ）是DNA的信使 ，完成任务后应该迅速降解。 （3 ）酶促水解 不同性质的核酸酶（Pu表示嘌呤，Py表示嘧啶） 核酸的分离、纯化和定量  核酸的抽取 ① 两种核蛋白的分离 ② 蛋白质的去除 ③ 核酸的沉淀  电泳  离心  层析  核酸的纯度的检测和定量 DNA一级结构的测定 ① Sanger发明的末端终止法或双脱氧法 ② Maxam和Gilbert 发明的化学断裂法 ③ 焦磷酸测序与深度测序 末端终止法  原理：ddNTP参入可导致DNA复制的末端终止  步骤： ① 进行四组平行反应 ② 每一组反应混合物含有四种ddNTP ③ 每一组反应含有一种少量的ddNTP ④ 在多数情况下，聚合酶使用正常的核苷酸，DNA合成正常延伸 ⑤ 有时，聚合酶使用ddNTP，而导致末端终止 ⑥ 每一组反应中ddNTP的随机插入留下一系列长度不等的以该双 脱氧核苷酸结尾的DNA链。 ⑦ 对每一组反应混合物走凝胶电泳 ⑧ 片段越短，走的越快，就越靠近凝胶的底部 ⑨ 从凝胶的底部向上读出序列 ⑩ 将读出的序列转化成互补链的序列 末端终止法图解 DNA 自动分析仪的组成 化学断裂法  原理：是用特殊的化学试剂，处理待测的具有末