核酸抽提包含样品的裂解和纯.pdfVIP

================================================ 1：核酸抽提原理 简单地讲，核酸抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯 化则是使核酸与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。 经典的裂解液几乎都含有去污剂 (如 SDS 、Triton X-100 、NP-40 、Tween 20 等) 和盐 (如 Tris 、EDTA 、 NaCl 等) 。盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境 (如 Tris) ，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中 对核酸的破坏 (如 EDTA) 、维持核酸结构的稳定 (如 NaCl) 等。去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结 构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能加入蛋白酶；利用蛋 白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核 酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂 (如 GIT 、GuHCl 等) 裂解的，该方法已经成为了 RNA 抽提的 主流，却不是基因组 DNA 抽提的主流。 最常用的纯化方法，一是 PC 抽提 + 醇沉淀，二是介质纯化。第一种方法是利用 PC 对裂解体系进行反复 抽提以去除蛋白质，实现核酸与蛋白质的分离；再用醇将核酸沉淀下来，实现核酸与盐的分离。第二种方法 则是利用某些固项介质，在某些特定的条件下，选择性地吸附核酸，而不吸附蛋白质及盐的特点，实现核酸 与蛋白质及盐的分离。高盐沉淀去除蛋白质是第一种纯化方法的一个变体，省略了 PC 操作的麻烦。当 然，也有不纯化的抽提方法，但是用途多局限于简单的 PCR 。其它杂质 – 如多糖、多酚等 - 的去除，基 本上都是在这两种方法的基础上，通过增加一些特别的试剂，或者增加一些额外的步骤来实现的。 2 ：了解你的实验样品 如果你研究某个实验样品，并且要抽提它的核酸，以下的信息一定要先行收集：该样品的核酸含量、酶含 量、特殊杂质含量。如果你对样品的特点一无所知，当样品稍微有一点复杂时，抽提核酸的实验就会碰到许 多问题。以血液为例，如果你不知道鸟的血液中有核细胞的含量是人血的千倍左右，而使用人血一样的起始 量去抽提鸟血的基因组 DNA ，怎么可能成功？失败了又怎么知道原因所在？同时，只有对实验样品有所了 解，才能正确选择裂解方法。 绝大部分情况下，使用新鲜样品可以获得最好的结果。对一些杂质含量高的样品，如果使用新鲜样品抽提基 因组 DNA 是碰到杂质残留过大的问题，可以试一下 -20C 保存一天后再抽提的对策，可能会有意想不到 的效果。样品如果因为某些原因必须先行保存，也要先简化一下样品：血液最好只保存有核细胞；将样品分 割后保存，避免反复冻融。如果实验室不具备合适的保存条件，将样品先裂解后再保存，是一个不错的选 择。 3：裂解方法的评价 含蛋白酶的裂解方法，可以认为是抽提基因组 DNA 的首选。裂解包括膜蛋白的游离和与基因组 DNA 相 连接的蛋白质的游离。蛋白酶的作用是使蛋白质变小，故而对蛋白质的游离有巨大的促进作用；同时，巨大 的基因组 DNA 是很容易“缠”住大分子的东西的，蛋白质被蛋白酶消化变小后，则不容易被基因组 DNA “缠”住，有利于蛋白质在纯化操作中的去除，使最终获得的基因组 DNA 的纯度更高。另外一个思路是， 如果基因组 DNA 与蛋白质 “缠”在一起，在纯化的过程中有两种可能：如果基因组 DNA 的特性占优势， 则纯化时以 DNA 的形式被保留下来，导致蛋白质的残留；如果蛋白质的特性占优势，则纯化时以蛋白质 的形式被去除，导致 DNA 的损失。有些样品，如肌肉，即使是 RNA 抽提，也强烈建议使用含蛋白酶的 裂解液 (或者在操作中的某个时候使用蛋白酶消化蛋白质) ，原因在于这些样品中的蛋白质，是非常难以去 除的。该方法是获得最大得率和最高纯度的基础。 不使用蛋白酶的去污剂裂解方法，仍然在细胞基因组 DNA 抽提方面有优势，尤其是当得率和纯度要求不 是最高，