《Illumina平台测序原理及常见测序文库构建》.pptVIP

形成的双 链的桥 Paired End Turnround 模板链 Paired End Turnround 等温变性，完成15轮桥式 PCR后，进行线性化，将模 板链切除，保留新合成的子 链 新合成的 链 3’ -OH阻 断 Read2测序引 物 Paired End Turnround 线性化，3’ -OH阻断 杂交Read2测序引物 Sequencing By Synthesis 2nd Read X 36 - 151 4种 Fl-NTP’s + 聚 合酶 拍照，收集信号 去阻断，切除荧光基团 Illumina 测序流程 HCS/RTA ICS MSR CASAVA BaseSpace 文库构建(~ 6 hrs) cBot HiSeq2500 1-8 samples MiSeq HiSeq2000 HiSeq2500 1-8 samples GA IIx MiSeq 第二部分：常见文库构建流程简 介 文库分类 DNA类文库 DNA小片段文库 DNA大片段文库 Exon文库 PCR-Free文库 简化基因组文库、单细胞样本 文库等 RNA类文库 转录组文库 表达谱（RNA-Seq） Small RNA DNA小片段文库 DNA小片段文库 片段大小在1Kb以下的普通DNA文库 （200bp,350bp,500bp…） DNA小片段文库可用来进行人重测序，动植物、 微生物的de novo和重测序，16s rRNA测序， 宏基因组测序等项目类型的文库构建。 DNA小片段建库流程 DNA小片段建库流程 DNA小片段建库流程 DNA小片段建库流程 DNA大片段文库 DNA大片段文库，又名末端配对（mate-paired） 文库 片段长度大于1K bp。 主要用于动植物，微生物的de novo 测序 DNA大片段文库建库流程 DNA大片段文库建库流程 为什么要建大片段文库 Exon文库 人类外显子组总共约30Mb，占全 部人类基因组约1%。 外显子具有高度的保守型，且大部 分疾病的致病位点位于外显子区。 外显子测序是指利用序列捕获技术 将外显子区域DNA捕捉并富集后 进行高通量测序的基因组分析方法。 Exon文库主要用于人全外显子测 序和目标区域测序 Illumina 平台测序原理及常见几 种测序文库构建流程简介 目录 第一部分：测序测序原理与流程 简介 文库构建(~ 6 hrs) cBot HiSeq2500 MiSeq HiSeq2000 HiSeq2500 GA IIx MiSeq HCS/RTA ICS MSR CASAVA BaseSpace 1-8 samples 1-8 samples DNA Illumina 测序流程 文库构建(~ 6 hrs) cBot HiSeq2500 1-8 samples MiSeq HiSeq2000 HiSeq2500 1-8 samples GA IIx MiSeq HCS/RTA ICS MSR CASAVA BaseSpace DNA 文库构建流程 片段化 DNA 末端补平 3’加A 接头连接 PCR 高质量DNA文库结构 文库构建的目的是在目的DNA片段两端都连接上想要 的接头 此单链部分与 FlowCell表面上P7接 头相同 此单链部分与 FlowCell表面上P5接 头相同 Index Sequencing Primer 文库构建(~ 6 hrs) cBot HiSeq2500 MiSeq 1-8 samples HiSeq2000 HiSeq2500 1-8 samples GA IIx MiSeq HCS/RTA ICS MSR CASAVA BaseSpace 测序芯片 (Flow Cell)简介 flow cell是有2个或8个泳道(Lane)的 玻璃片，与一元硬币的厚度相当 每个泳道(Lane)内的上下两个表面 随机的布满了能够与文库两端接头 分别互补配对的寡核苷酸(oligos,P7 和P5接头) 在flow cell上进行cluster簇生成 仪器简介 单条DNA 模板 约1000条 DNA模板的 拷贝 cBot HiSeq Sequen ncceerr 35个循环的桥式PCR cBot 工作流程 DNA文库变性：使用NaOH将双链DNA文库变性为单链 模板链杂交： 将单链DNA模板杂交到Flow Cell 上 第一链合成： 以Flow Cell 表面上的oligos为引物， 合成第一链 桥式PCR： 冲走单链DNA模板，以合成的第一链 为模板进行35循环的桥式PCR 线性化： 将与P5接头连接的DNA链从Flow Cell 上去除 阻断3’–OH： 防止在后续测序过程中继续延伸DNA链 杂