实验五 电泳技术 PAGE.pptVIP

（三）聚丙烯酰胺凝胶电泳 1、概述：聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electropho resis PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，对pH和温度变化小，没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acry-lamide，简称Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（methylane bisacrylamide，简称Bis）在催化剂作用下合成的。 聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用范围： PAGE应用广泛，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备，还可测定分子量、等电点等 二、聚丙烯酰胺凝胶的制备 2. 光聚合 光聚合通常用核黄素为催化剂，核黄素经光照形成无色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引发聚合反应。TEMED的存在，可以加速聚合。 上述聚合反应受许多因素的影响： （1）大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增加。在进行化学聚合前，一般用减压抽气的办法除去溶液中溶解的空气。在胶液表面，往往覆盖一层水或溶液，隔绝空气，可加速聚合。 （2）低温、低pH都会减慢聚合反应速度。 （3）有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金属等可抑制聚合反应。 聚丙烯酰胺凝胶有以下优点： ①几乎无电渗作用。 ②化学性能稳定，与被分离物不起化学反应。对pH和温度变化较稳定。 ③在一定浓度范围内凝胶无色透明，有弹性，机械性能好，易观察。 ④凝胶孔径可调。 ⑤分辨率高，尤其在不连续不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，因而有更高的分辨率。 凝胶的物理性质如机械强度、弹性、透明度和粘着度都取决于凝胶总浓度（T）和Acr与Bis两者之比。凝胶总浓度（T）和交联度（C）的计算公式分别为： T= C= 凝胶孔径大小，主要受凝胶浓度的影响。凝胶浓度越大，孔径越小。凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断。浓度过小，凝胶稀软，不易操作，也易断裂。当凝胶浓度确定后，交联度为5%时，凝胶具有最小孔径，超过5%或低于5%时凝胶孔径都要增大。 在浓度为7.5% 的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到满意的分离效果。因此，把浓度为7.5% 凝胶称为标准胶。对于一个未知样品，常用7.5%的标准胶或4%-10% 的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的凝胶浓度。 聚丙烯酰胺凝胶电泳系统的组成： 聚丙烯酰胺凝胶电泳根据其有无浓缩效应，可分为连续的和不连续的两类 。 前者指整个电泳系统中所用缓冲液，pH值和凝胶网孔都是相同的；后者是指在电泳系统中采用了两种或两种以上的缓冲液、pH值和孔径，不连续电泳能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨能力。 在不连续PAGE系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。 电荷效应：各种蛋白质按其所带电荷的种类及数量，在电场向一定电极，以一定速度泳动。 分子筛效应：区别不同大小分子种类的能力是凝胶所具有的一种筛分大小的能力即分子筛效应。这种效应与凝胶过滤过程中的情况不同。 浓缩效应： SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS) 电泳相关技术 电泳印迹 电泳转移即电泳印迹。它是利用低电压，大电流的直流电场使凝胶电泳的分离区带或电泳斑点转移到特定的膜上 。 說明文字 表 3.3? 三個假設蛋白質的性質比較： 圖 3.6? Disc與 SDS的比較： 說明文字 Bio-Rad电洗脱槽 Bio-Rad电泳仪 水平板式电泳槽 垂直板式电泳槽 Bio-Rad垂直板式电泳槽系统 凝胶扫描仪 凝胶真空干燥仪 凝胶成像仪 1. 凝胶干燥和扫描技术 Bio-Rad 凝胶成像系统 2. 凝胶成像技术 核酸分子杂交 核酸分子杂交技术是在1968年由Britten及其同事发明的，是指非同一分子来源但具有互补序列（或某一区段互补）的两条多核苷酸链，通过Watson-Crick碱基配对形成稳定的双链分子的过程，若其中的一条链被人为标记上，该标记可以通过某种特定方法检测出，即成为所谓的探针。探针与其互补的核苷酸序列杂交后，杂交体也就带上了同样标记，可被检测出来。这样，以特定的已知核苷酸序列做探针，就可以在诸多的核苷酸序列中，通过杂交探测出与其互补的序列，因而分子杂交是进行核酸序列分析，重组子鉴定，检测外源基因整合和表达的强有力的手段。它具有灵敏性高（可检测出10-12g,即1pg DNA样品）、特异性强的特点。 蛋白质分子杂交 是利用抗原与抗体特异结合的原理检测外源基因表达情况的方法。