干细胞基础与临床应用基础 研究.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 三、原代培养 1 原代培养的概念： 1、是指“初次培养”的含义，没有培养物的分割。 2、“代”只是分割的记录与记数形式，与细胞分裂增殖的“代”不同。 3、植块培养也可以分割，故也可以进行传代培养 4、更换培养液、更换培养器皿，仍是原代培养。 三、原代培养 2 基本目的： 1、维持目的细胞在体外条件下生存一段时间,适应体外培养的新环境。 2、更接近原来的组织形式，有利于目的细胞适应体外培养的新环境。 3、使目的细胞在体外条件下稳定生长、扩增，形成优势群体。 三、原代培养 3 植块培养 植块培养目的： 1、观察组织生长行为及其规律。 2、获得向外迁移的细胞（应该有相应的松解、离散措施）。 植块培养的优点： 保持了良好的3D组织结构、维持了细胞之间的相互作用，细胞易于成活和生长。 植块培养的缺陷： 植块中央的物质交换受局限。适宜大小！1mm3 植块培养的关键： 1、植块的贴壁、固定。 2、培养液的添加。 3、如果是为了获得细胞，要注意植块的适时移出。 三、原代培养 4 细胞培养 优点：能在特定条件下，获得单一类型的细 胞并进行相关的研究。 关键：使细胞尽快进入分裂、增殖的生长状态。 1、促进细胞贴壁 2、适宜的细胞接种密度。 105 个/ml是常用的标准，但还应该考虑细胞类型、生长能力、活力。 干细胞的培养会选择更低密度？ 三、原代培养 5 培养空间 3、培养空间 构建适宜的培养体系： 培养体系由两大部分组成：液相和气相 调整培养空间的目的：保证细胞的供O2量 相关参数： （1）、液相∶气相 = 1 ∶ 10 （体积） （2）、液相高度：2～5 mm O2 O2 O2 四、传代培养 1 传代的目的： 1、避免接触性抑制，保持细胞稳定地生长。 2、进一步纯化细胞类型。 （1）不同的传代处理方式 （2）不同的处理强度 传代的指标： 1、体细胞：集落占据80%～90%的瓶底面积。 2、干细胞：根据目的细胞集落的生长状况，有必要时。 四、传代培养 2 传代的基本步骤： 1、换液 一些技术手册要求传代前一天换液，主要 是改善细胞状态，增强适应能力。 2、解离细胞 目的细胞的生物学特性决定解离细胞方法 酶消化法 机械震荡法 3、再次接种 传代的关键： 1、适当的时间 2、适当的方法 3、适当的细胞密度 五、“二倍体细胞”的问题 细胞性状的稳定，是体外培养条件下，研究体内细胞生物学性状的前提。 问题：在较长时间和不适宜条件下的体外培养，由于细胞融合等已知和未知的原因，细胞的染色体倍数会发生变化，成为多倍体细胞。 营养条件 理化条件 生活环境 遗传物质基础 传代 六、体外培养细胞的生长与观察 1 在体外培养条件下，细胞的生长行为会有相应的变化，对其研究的目的是： 1、了解细胞的生长行为的基本规律； 2、区分质变与量变，判断目的细胞的价值和意义。 A、 体外培养细胞的生长方式： 1、黏附型 2、悬浮型 六、体外培养细胞的生长与观察 2 黏附型细胞 黏附是体外培养条件下恢复“组织形式”的倾向 1、细胞与细胞之间的接触 2、细胞与细胞外基质结合 体内、体外的差异：体内是立体三维的结构；而体外只是二维的空间，大多数情况下只有一个附着面。故细胞的外形会有变化。 六、体外培养细胞的生长与观察 3 黏附型细胞的类型： 1、上皮型细胞（上皮样细胞）： 细胞镶嵌状紧密排列，呈“铺路石样”；起源于内胚层、外胚层的细胞多呈此型。 六、体外培养细胞的生长与观察 4 2、成纤维细胞（成纤维细胞样）： 细胞梭形、多角形、胞体铺展，细胞间隙较大，细胞排列疏松；细胞可呈放射状、螺旋状排列。起源于中胚层的细胞多成此型。 六、体外培养细胞的生长与观察 5 3、多形型细胞 细胞有较长的突起、胞体多角形，可分为胞体部和突起部，细胞间距大。 常见类型：神经组织细胞。 六、体外培养细胞的生长与观察 6 4、游走型细胞： 细胞分散、不易形成集落； 可有胞质突起，细胞变形、游走活跃。 见于单核吞噬细胞系统、肿瘤细胞。 六、体外培养细胞的生长与观察 7 铺展： 球形 原饼形