5基因工程操作的工具酶(2).ppt

基因工程的工具酶（instrumental enzyme of gene engineering）是应用于基因工程各种酶的总称，包括核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因制取、重组体DNA制备等所需要的酶类。 限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类—用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等。 Ⅰ型限制酶（无用） 1968年，M. Meselson和R. Yuan在E.coli B和E.coli K中分离出的核酸内切酶。 分子量：30万dal左右 组成：3种亚基 特异性亚基：具特异性识别DNA序列的特性。 修饰亚基：具甲基化酶活性。 限制亚基：具核酸内切酶活性。 辅助因子：需Mg2+、ATP和SAM。 识别和切割位点：不一致（距识别位点5’一侧数千碱基处随机切割DNA分子）。 Ⅱ型限制酶（十分有用） 1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血Rd株中分离出来的限制酶。 分子量：2万～10万dal（较小） 组成：一种多肽，常以同源二聚体形式存在。 辅助因子：无需辅助因子，或只需Mg2+。 识别和切割位点：相一致。 Ⅲ型限制酶（无用） 组成：两个亚基 M亚基：负责位点的识别与修饰。 R亚基：具核酸酶的活性。 辅助因子：需Mg2+、ATP和SAM 识别和切割位点：不一致（距识别位点一侧约25bp处切割DNA分子）。 限制酶的命名 ?6 个碱基识别位点： 　　EcoRⅠ G↓AATTC? HindⅢ 　 ?A↓AGCTT ?7 个碱基识别位点： 　　　BbvCⅠ ?CC↓TCAGC? 　　　PpuMⅠ ?RG↓GWCCY ?8 个碱基识别位点： 　　　NotⅠ GC↓GGCCGC ?　　　SfiⅠ GGCCNNNN↓NGGCC 　　 当识别序列为 4 个和 6 个碱基时，它们可识别的序列在完全随机的情况下，平均每 256 个和 4096 个碱基中会出现一个识别位点（44=256，46=4096）。 二、限制性核酸内切酶作用机制 二硫苏糖醇(DTT)或β—巯基乙醇： 　　维持酶活性的稳定。 Tris-HCl或Tris-Ac： 　　维持酶活性适合的pH环境。 利用限制酶对DNA进行消化的具体步骤： 不同的限制酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此，所以建议遵循与酶一起提供的说明书进行操作。 以下是对0.2-1.0ugDNA进行消化的典型反应步骤，如要对更大量的DNA进行消化，则反应的各个成分须相应放大。 加入合适体积的DNA溶液； 加入2ul适当的10X限制酶消化缓冲液，轻敲管外壁以混匀之； 加入1-2单位限制酶，轻弹管外壁以混匀之； 将上述混合的反应物置于适当温度并按所需的时间进行温育； 加入0.5M/L EDTA（pH8.0）使终浓度达10mM/L，以终止反应； 如果消化后DNA直接进行凝胶电泳分析，可加入6ul凝胶电泳加样缓冲液混合后，再加样进行电泳。 如欲纯化酶切后的DNA，可用酚和氯仿抽提后，乙醇沉淀DNA。 使用限制酶的注意点： 限制酶十分昂贵! 为能从贮存管内取出极少量的酶，只要用移液器吸头在酶溶液表面轻沾一下即可，这样可以取到少至0.1ul的酶。浓缩的限制酶也可在使用前用限制酶缓冲液稀释，但切勿用水稀释以免酶变性。 限制酶在50%甘油中保存于-20℃时是稳定的。进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后加以混匀，再从冰箱内取出贮酶管，立即放置于冰上。每次取酶时都应换一个无菌吸头，一旦限制酶中污染了DNA或其它酶，将造成财力和时间上的浪费。操作要尽可能快，用完后立即将酶放回冰箱，以使酶在冰箱外放置的时间尽可能缩短。 尽量减少反应中的加水量以使反应体积减到最小，但要确保酶体积不超过反应总体积的1/10，否则，限制酶活性将受到甘油的抑制。 通常延长消化时间可使所需的酶量减少，这在切割大量DNA时不失为一大节约方法。在消化过程中，可取少量反应液进行电泳以判断消化程度。 用途 复制较长的模板，在测序中可读出较长的序列 用填补或交换反应快速进行末端标记。 ? 与 T４DNApol一样，平齐粘性末端。 定点突变中互补链的合成。 5′ 3′ 3′ 5′ 修饰的 T7 DNA 聚合酶(测序酶) ?来源： 天然 T７DNA 聚合酶经修饰处理 ?结构： 同T７聚合酶。 用还原剂、分子氧、低浓度 Fe２+与酶保温几天，可使Phage T7