第6章基因操作中大分子的分离和分析.pptVIP

* 西南大学生物技术专业 基因工程 * * 西南大学生物技术专业 基因工程 * * 西南大学生物技术专业 基因工程 * Southern Blotting的过程 1.碱变性的琼脂糖凝胶电泳分离的DNA 2.通过电泳液的移动转移胶中的DNA 3.固定胶中的DNA 4.预杂交和杂交(放射性和荧光检测) 5.结果检测 * 西南大学生物技术专业 基因工程 * Southern印迹杂交方法操作简单，结果十分灵敏，在理想的条件下，应用放射性同位素标记的特异性探针和放射自显影技术，即使每带电泳条带仅含有2ng的DNA也能被清晰地检测出来。 * 西南大学生物技术专业 基因工程 * 1.硝酸纤维素滤膜 在印迹技术中，硝酸纤维素滤膜是目前应用最广的一种固相支持物，但它存在一些不足之处: （1）硝酸纤维素滤膜是依赖疏水性相互作用结合DNA的，这种结合并不十分牢固，随着杂交及洗膜进程，DNA会慢慢脱离硝酸纤维素滤膜，从而使杂交效率下降。 （二）Southern杂交的杂交滤膜 * 西南大学生物技术专业 基因工程 * （2）硝酸纤维素滤膜质地较脆弱，容易碎裂，因此操作须小心谨慎 (特别是经烘烤后)。 （3）硝酸纤维素滤膜与核酸的结合有赖于高盐浓度，在低盐浓度时结合DNA效果不佳，不适宜于电转印迹法。 （4）硝酸纤维素滤膜对于小分子质量的DNA片段 (特别是小于200bp的DNA片段)结合能力不强。 * 西南大学生物技术专业 基因工程 * 2. 尼龙膜 优点： 结合DNA和RNA的能力强于硝酸纤维素滤膜，对小分子质量的核酸也能较好地结合。 尼龙膜韧性强，操作较方便，对离子浓度要求不高，可重复用于杂交。 缺点： 杂交信号本底较硝酸纤维素滤膜高。 * 西南大学生物技术专业 基因工程 * 将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。 二 Northern杂交 * 西南大学生物技术专业 基因工程 * Northern杂交的过程 ①提取总RNA。 ②分离mRNA。利用亲和层析的原理纯化mRNA。 ③制备RNA探针。根据mRNA序列合成同源DNA探针，或以cDNA为探针。 ④Northern杂交。Northern杂交的方法包括点杂交和印迹杂交，两者都能鉴定外源基因是否得到转录，但后者还能确定mRNA分子质量大小及丰度。 * 西南大学生物技术专业 基因工程 * 三 菌落原位杂交 （colony in situ hybridization） ●1975年，M.Grunstein和D.Hosnese根据检测重组子DNA分子的核酸杂交技术原理,对Southern印迹技术作了一些修改,提出了菌落原位杂交技术。该项技术是直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上,经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合,再与特异性DNA探针杂交,筛选出含有插入序列的菌落。 * 西南大学生物技术专业 基因工程 * 菌落原位杂交的操作步骤 * 西南大学生物技术专业 基因工程 * * 西南大学生物技术专业 基因工程 * 四 Western杂交 是将蛋白质电泳、印迹和免疫测定结合在一起的检测方法，具有很高的灵敏度，可从总蛋白中检测出50ng的特异性表达蛋白。 * 西南大学生物技术专业 基因工程 * Step 1. Antibody Recognition of target protein/antigen Step 2. Secondary Antibody recognition of primary Ab Step 3. Color Development Western杂交的操作步骤 * 西南大学生物技术专业 基因工程 * Western Blot 检测HIV * 西南大学生物技术专业 基因工程 * ◆ Southern印迹法(DNA印迹法,Southern blotting)：是一种把DNA电泳分离区带转移到支持膜上的技术。因这一技术是英国科学家E.M.Southern首先创建的，而且这一转移过程与墨迹被吸印到吸墨纸上的过程相似，所以用他的姓氏命名为Southern印迹法。 ◆ Northern印迹法(RNA印迹法,Northern blotting)：Alwine等人将Southern印迹法应用于RNA，原理与Southern印迹法相似。Alwine等人根据命名Southern印迹法的姓氏中含有“南部” 之意，风趣地把他们的RNA印迹法称为“北部”印迹法（Northern blotting）。 * 西南大学生物技术专业 基因工程 * ◆ Western印迹法（蛋白质印迹法，Western blotting）：是一种从混合蛋白质中检出微