分子生物学技术整理.doc

PAGE PAGE 1 分子生物学要点整理 DNA操作的基本技术 核酸分子杂交 A、原理 核酸分子杂交：指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。 B、基本技术 探针：已知序列的标记的核酸片段 C、具体应用 印迹杂交技术 利用Southern印迹法可进行基因的定性及定量分析、基因突变分析，限制性片断长度多态性分析（RFLP），DNA甲基化检测等。 1.遗传病诊断 　　 2.DNA图谱分析 　　 3.DNA克隆鉴定 Northern印迹法可用以检测某一特定的RNA（通常是mRNA）片段的存在及表达量，比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况 1.肿瘤跟踪 　　 2.mRNA剪切 斑点印迹杂交 （dot blot) 简单、快速，同一张膜可检测多个样品 特异性不高、不能鉴别核酸分子量 用于表达量分析 原位杂交（in situ hybridization，ISH）即利用分子杂交技术来进行基因及其表达产物定位分析的一种技术；可用于基因及其表达产物的定位分析。 特点：能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究；不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高；能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态。 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH） 将标记探针与细胞或组织中的核酸进行特异性杂交，并应用组织化学方法在显微镜下进行细胞内定位的检测技术。可进行多色杂交，可检测DNA及RNA特定序列。 基因组原位杂交（genome in situ hybridization，GISH） 用一个物种的基因组DNA作为探针，对另一物种的染色体进行原位杂交，通过对杂交信号在染色体上分布及信号强弱分析，判断基因组间DNA相似性，基因同源性，亲缘关系，及进化关系。 基因表达定位及定量： RNA原位杂交 RNA或寡核苷酸作为探针 主要做内源基因定性，定量分析 灵敏度较高 整体原位杂交（Whole mount in situ hybridization, WISH） 适用于早期胚胎发育或体积微小的组织器官RNA表达研究 可做时空表达图谱研究 信噪比较高 聚合酶链式反应 分析基因及其产物 反转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）是将RNA的反转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。 RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。 进行实时、定量分析（实时定量PCR，real-time quantitative PCR, RT-qPCR） 测定DNA拷贝数最敏感、最准确的方法 实时精确定量，灵敏度强，特异性高，实现多重反应，无污染 在肿瘤、乙肝和性病的诊断和治疗中广泛应用 结合免疫共沉淀扩增蛋白质结合的DNA序列 DNA序列测定 DNA序列分析可以揭示基因和基因组一级结构变化 通过DNA序列分析可以鉴定基因和基因组的变异 通过DNA序列测定分析人工重组的基因 通过DNA序列测定对定点突变进行确认 基因工程，用以建立基因数据库，及遗传病分析 DNA芯片（DNA chip）技术 在同一基片上有序固化寡核苷酸或DNA探针，与待测荧光标记样品进行杂交；通过对杂交信号的检测、比较和分析，得出样品的遗传信息(基因序列及表达)；亦被称作DNA微阵列(DNA microarray)。 （绿、黄、红） 染色质免疫共沉淀芯片（chromatin immunoprecipitation-chip，ChIP-on-chip） 特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，解交联后对目的片段进行纯化、扩增和荧光标记，再用于芯片分析，检测蛋白质-DNA相互作用 芯片技术的发展——蛋白质芯片和组织芯片 蛋白质芯片技术是研究蛋白质组学的有力工具 蛋白质检测芯片 蛋白质功能芯片 组织芯片是以形态学为基础进行高通量检测基因表达信息的芯片技术 多组织片 组织阵列 组织微阵列 应用 DNA芯片可同时进行高通量基因转录活性的分析 染色质免疫共沉淀与芯片技术结合检测蛋白质-DNA相互作用，寻找特异性蛋白在基因组中的结合位点，获得蛋白质与DNA相互作用的信息。ChIP-on-chip适于DNA-核蛋白相互作用及表观遗传学研究，用来确定转录因子及其作用位点或确定基因表观遗传修饰，应用于表观遗传学研究 蛋白质芯片可用于蛋白表达谱分析及蛋白功能分析，可用于肿瘤标记物筛选，肿瘤诊断及治疗效果检测 组织芯片可用于高通量检测基因表达信息，可用于肿瘤标记物筛选，肿瘤诊断及治疗效果检测 酵母及哺乳动物细胞杂交系统 酵母双杂交系统 酵母双杂交系统利用报告基因的表达探测蛋白-蛋白的相互作用 酵母双杂交可通过蛋白质相互作用鉴定或