§7.4免疫组织化学与免疫印迹技术.pptVIP

* * §7. 4 免疫组织化学与免疫印迹技术 利用抗原-抗体间的特异反应，通过标记抗体，可现场观察组织切片或细胞样品中抗原的种类与位置，称为免疫定位分析。这种方法将免疫反应的特异性和灵敏度与显微镜的精密度结合起来，能比较快速地测出少量抗原或抗体在细胞内或组织内的定位及分布，因此可用于免疫细胞化学和免疫组织化学的检测。对某些生物功能分子在细胞或组织中的表达和定位是非常有效的方法之一，在临床医学、病毒学、免疫学以及生物学基础理论的研究中日益得到广泛的应用。 常用的标记方法有荧光染料、酶和胶体金或银纳米粒子。相应的检测方法分别为免疫荧光分析（或称为荧光抗体技术）、免疫酶染法和胶体金技术。前者用荧光显微镜，后两者用电子显微镜进行观察与测量。检测时，样品在与标记抗体反应后常需彻底冲洗以免非特异性反应干扰观测。 §7. 4. 1 免疫荧光分析 将荧光素（异硫氰荧光素或异硫氰四甲基罗丹明，600 nm，深红色）等荧光色素用双功能交联剂标记在抗体的Fc段，这一过程不影响抗体与细胞或组织中抗原的特异性结合，标记的抗体可直接与组织切片或细胞中的抗原结合，经反应和洗涤后在荧光显微镜下进行观测。 标本中如有相应抗原存在，即与荧光抗体特异结合，在镜下可见有荧光的抗原抗体复合物，这一方法称为直接法。此法的优点是简单、特异。但其缺点是检查每种抗原均需制备相应的特异性荧光抗体，且敏感性低于间接法。常用于细菌、病毒等的快速检查和淋巴细胞表面抗原与受体的鉴定。 间接法是根据抗球蛋白试验的原理，用荧光物质标记抗球蛋白抗体（第二抗体或抗抗体，一般是抗人IgG）（简称标记抗抗体）。检测过程分为两步：第一步，将待测抗体（第一抗体）加在含有已知抗原的标本片上，作用后，洗去未结合的抗体。第二步，滴加标记抗抗体。如果第一步中的抗原抗体已发生结合，此时加入的标记抗抗体就和已固定在抗原上的抗体（一抗）分子结合，形成抗原—抗体—标记抗抗体复合物，并显示特异荧光。 此法的优点是敏感性高于直接法，而且只需制备一种荧光物质标记的抗球蛋白抗体，就可用于检测同种动物的多种抗原抗体系统。亦可用荧光物质标记葡萄球菌A蛋白，代替标识抗球蛋白抗体用于间接法荧光染色，且不受第一抗体来源的种属限制，但敏感性低于标记抗抗体法。间接法的缺点是有时易产生非特异性荧光。此法常用于各种自身抗体的检测。如果第一抗体为已知，间接法也可用于鉴定未知抗原。 §7. 4. 2 免疫酶技术 免疫酶技术是利用抗原抗体反应的特异性和酶促反应的放大作用，灵敏地检测组织细胞中抗原的定位和分布的一种方法。最早应用的免疫酶技术是免疫酶组织化学染色，即用酶标抗体与标本中的抗原进行特异反应，当加入酶的底物时，在酶的作用下经一系列反应产生不溶于水的有色产物，借助显微镜进行定位判断。 氧性酶桥法是利用第二抗体将与组织抗原结合的第一抗体和抗酶抗体结合在一起。第二抗体是作为桥将两种第一抗体连结起来，在检测时加入第二抗体后，再加HRP和抗HRP的复合物，如图7.14所示。PAP复合物含有3个HRP分子，因此该法灵敏度比酶标抗体法高20~25倍。 图7.14 过氧化物酶抗过氧化物酶染色法示意图 §7. 4. 3 滴金免疫分析 滴金免疫分析又称为免疫金技术，它是在1971年由Faulk和Taylor等提出并应用于免疫组织化学研究的。1974年Romano等在抗抗体上标记胶体金，建立了间接免疫金染色法。所谓胶体金，是指在分散介质中存在由1～100 nm大小的金颗粒所形成的分散体系，即胶体溶液。它可利用还原剂乙醇、过氧化氢、白磷、硼氢化钠、抗坏血酸、柠檬酸三钠等还原氯金酸（HAuCl4）制成。 胶体金颗粒的大小可通过对还原剂用量的控制来实现，还原剂用量愈大，颗粒愈小。金颗粒吸附抗原或抗体后即形成胶体金标记的抗原或抗体，用于免疫印迹、免疫组织化学定位或快速免疫渗滤（滴金免疫）试验。这一方法既可在光学显微镜下，也可在电子显微镜下观测。后者又称为免疫电子显微镜技术（IEM），它大大提高了电镜观察的特异性。 胶体金技术的制备和操作都很简便，无需特殊设备，显色底物无致癌作用，且染色结果可以长期保存。可应用大小不同的金颗粒标记不同的特异性抗体，可以同时定位两种以上的组分或抗原决定簇在细胞内的分布。根据颗粒多少还可以对特异性抗原成分的强度进行估计。在用作细胞内抗原定位时，由于直径10 nm金粒子不易穿透组织，故用5 nm金胶为宜。目前流行于市面的HCG早孕检测试纸，就是利用免疫胶体金显示的，其灵敏度可达50 mIU mL-1。 胶体金标记抗原/抗体的机理尚不清楚。一种说法是认为胶体金表面带有