肺神经内分泌细胞及其肿瘤的形态学分析.docx

中文摘要现存在于胰腺等外周器官并被证实有收缩血管的作用。那么NPY是否 中文摘要 现存在于胰腺等外周器官并被证实有收缩血管的作用。那么NPY是否 也存在于肺内?肺内分泌细胞能否合成NPY?NPY在肺内的作用及 与其他活性物质的关系是怎样的?这成为本课题设计的一个目的。 国内外学者对肺神经内分泌细胞进行的一系列观察和报道发现， 肺神经内分泌细胞在胚胎发育过程中异常活跃，与其在正常成体肺组 织存在很大的差异。因此，对动物肺内NPY、5-HT、CGRP所表达的 增龄变化的观察将有助于我们对肺的发生、发育的全面了解。 本课题以嗜铬颗粒蛋白A，即嗜铬素A(chromogranin A，CgA)作 为肺神经内分泌细胞的特异性标记物，首先从翻译和转录两方面对 NPY在肺内的表达进行了研究；同时对NPY与5-HT、CGRP和CgA 在肺神经内分泌细胞内的关系进行了观察。然后对增龄大鼠肺内 NPY、5-HT和CGRP表达的变化进行了动态观察。 晚近的研究认为，肺神经内分泌肿瘤与胚胎肺发育中神经内分泌 细胞有某些相似之处。因此，我们对NPY在肺神经内分泌肿瘤的表达 进行了观察，以期为肺内分泌肿瘤发生的病理学提供实验资料。 CgA由于能与特异性激素结合而广泛存在于神经内分泌细胞及 其肿瘤的内分泌颗粒中，被认为是神经内分泌细胞和神经内分泌肿瘤 特异、敏感、可靠的标记物。在神经内分泌癌的病理诊断学上具有十 分重要的意义。本实验中用CgA作为肺神经内分泌细胞的特异性标记 物，观察CgA与NPY、5-HT、CGRP在肺NEC中的关系；比较CgA 与其他标记物在人肺神经内分泌肿癌中阳性表达的情况，以期为肺内 分泌肿瘤的临床病理诊断提供一定的形态学参考。 第一部分：NPY与5-HT、CGRP、CgA在大鼠肺组织的表达 目的：观察大鼠肺内NPY免疫反应阳性物质的表达情况；观察 NPY同CGRP、5-HT、CgA免疫反应阳性细胞的关系。初步探讨这些 活性物质之间的关联性，为揭示肺的内分泌机制、进一步认识肺的结 构和功能提供形态学资料。 方法：应用免疫组化单标、免疫荧光双标和原位杂交技术，利用 光镜、透射电镜和激光共聚焦扫描显微镜进行观察、照相。光镜、激 光共聚焦扫描显微镜切片制备：选用健康新生和孕20日SD大鼠各6 只，雌雄不限。新生大鼠结扎气管后迅速断头放血，行Bouin液气管 中文摘要灌注，再全肺固定1小时。待肺组织稍稍变硬后，选取带有各级支气 中文摘要 灌注，再全肺固定1小时。待肺组织稍稍变硬后，选取带有各级支气 管的左上肺组织多块，置入相同的固定液中固定；孕鼠活杀后迅速打 开子宫，取出活胎鼠，打开胸腔取全肺浸入新配制的Bouin液固定。 常规石蜡包埋、连续切片，片厚6 u m。分别进行以NPY、5-HT、CGRP 和CgA为一抗的免疫组织化学染色：按一抗不同种属来源分别进行 CGI心与NPY、CGRP和5-HT；CgA与NPY、CgA和5-HT荧光双 标免疫组织化学染色；以NPY寡核苷酸为探针进行原位杂交。透射电 镜样品制备：实验动物秤重、麻醉后，取材步骤同上，固定液采用2．5％ 戊二醛，肺组织取材后切为lmm3的细块。投入相同的固定液中，室 温下固定48小时。将组织块经PBS充分冲洗，l％锇酸后固定。丙酮 梯度脱水，Epon812包埋。Leica超薄切片机切片，片厚70nm。枸橼 酸铅和醋酸铀染色，日立H．7500型透射电子显微镜观察。 结果：1．光镜观察结果：①NPY免疫反应阳性细胞以单个神经内 分泌细胞(NEC)多见，而神经上皮小体(NEB)较少，在肺内支气 管树的粘膜上皮细胞中均有分布。可见NPY．IR阳性神经纤维，主要 位于气道平滑肌和血管壁。②cGIo免疫反应阳性细胞可为单个神经 内分泌细胞或多个神经内分泌细胞组成的神经上皮小体，零散分布于 肺内支气管树的粘膜上皮细胞中。在有些NEB的基底部可观察到呈 CGRP．IR阳性的神经纤维，沿肺内支气管和血管分支走行的神经纤维 亦可呈CGRP．IR阳性。③5．HT免疫反应阳性细胞可见于各级支气管 粘膜壁上，数量较少。在气道平滑肌和血管壁未观察到5-HT．IR阳性 纤维。④CgA免疫反应阳性细胞多为锥形、柱形，胞浆着色呈浅黄色， 细胞核较大不着色，多位于肺内支气管粘膜上皮。与NPY、CGRP和 5-HT免疫反应阳性细胞的表达部位基本一致。2．原位分子杂交结果： 在支气管的粘膜上皮细胞中可见NPY mRNA。3．相邻切片法、免疫组 化光镜观察和免疫荧光双重标记激光扫描共聚焦显微镜结果：NPY、 5-HT、CGRP既可单独存在于肺神经内分泌细胞中，也可共存于同一 肺的神经内分泌细胞中。其中以共存的情况较为多见，单独存在者较 少。4．用CgA作为肺神经内分泌细胞的特异性标记物，利用免疫荧光 双重标记激光扫描共聚