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聚合酶链式反应（PCR）原理与相关技术 一、PCR技术 二、定量PCR技术 三、数字PCR技术 一、PCR原理 Polymerase Chain Reaction(PCR)：在体外特异性地扩增某个基因。 1、历史 　1971年，Khorana提出体外人工复制DNA的设想。 　1985年　Cetus公司科学家K.B.Mullis使设想变成现　　　 　　　实，采用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37℃），　 　　　并获1993年诺贝尔化学奖。 　1988年　R.K. Saiki 应用Taq DNA聚合酶（水生栖热菌） 　　　于PCR反应；同年，Cetus公司发明自动热循环仪。 K.B.Mullis 2、原理 特异性强、灵敏度高、快速、简便 循环次数 DNA数量 1 2 2 4 3 8 20 1048576 30 1073741824 　1、Taq酶：具有5’→3’聚合酶和外切酶活性，无3’→5’外切酶活性，不　 　　　能修复错误的碱基配对，因此必须测序。需激活剂：Mg2+ 2、pfu DNA 聚合酶：有5’→3’和3’→5外切酶活性，出错率最低，但 　　　PCR产物平端。 　3、Taq Plus DNA 聚合酶：是Taq和pfu的混合物，Taq PCR产物3’端带－ 　　　A。 　4、引物：互补；引物长度；3’碱基序列必须与模板配对；尽量提高 　　　GC含量；避免连续相同碱基排列或开成回纹结构；避免形成引 　　　物二聚体。 　5、Tm=(G+C)×4+(A+C) ×2 　6、primer 5.0 　7、模板纯度：不一定要纯，但要确定不含蛋白变性剂、DNA酶、 　　　Mg2+螯合剂等。模板量（100ng/100μl） 　8、dNTP浓度　2.5 mM each 特殊说明： 普通PCR RT-PCR TAIL-PCR Real-time PCR 数字PCR PCR类型： 普通PCR仪 梯度PCR仪 原位PCR仪 定量PCR仪 数字PCR仪 二、实时荧光定量PCR（Real-time quantification PCR） 1、历史 　　实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它的特异性更强、更能有效解决PCR污染问题、自动化程度更高等特点。 原理：在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如 　　SYBR GREEN 1）或特异性的荧光探针（如Taqman探 　　针），利用荧光信号累积实时检测整个PCR过程，再　　 　　通过标准曲线或内参基因对未知基因进行定量分析 　　的方法。 　　也就是通过荧光的变化，获得不同样品达到一定荧光信号（阈值）所需要的循环次数Ct（Cycle Threshold）。 　　Ct值的含义：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。 1、荧光探针和荧光染料： 　　分别用探针或荧光染料与特异序列结合来指示扩增产物，前者特异性高，后者操作简单。 SYBR GREEN 1：结合双链DNA小沟后，荧光强度增强，但也会结合引物二聚体或单链引起的二级结构。变性时，双链分开，荧光消失。 特别说明： TaqMan探针：寡核苷酸探针，荧光基团连接在5’端，淬灭基因连在3’端。5’端荧光基团吸收能量后转移给临近的3’端淬灭基团，发生共振能量转移（FRET），只要探针完整，能量就会被淬灭。 荧光定量PCR的优点 荧光信号的强弱可实时反映DNA的扩增； 灵敏度极高，用于准确定量初始模板数量； 既能用于定性，判断一段DNA序列的有无，也可用于定量，确定起始DNA拷贝数。 一对引物 引物之间一条寡核苷酸，即探针 报告基因与淬灭基团 完整探针，不发光；水解后，发光。 FRET 变性（95℃） 退火（60℃） DNA聚合酶 荧光基团游离下来后发光了！ 因为探针是完全与目的基因互补，当它被水解后就发光，因此发光的强度与目标基因量成正比。 只与双链结合，发光；不与单链结合，不发光。 　　随温度升高，DNA双螺旋结构降解程度的曲线即熔解曲线，可用对数图和线性图表示。在扩增产物的溶解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链解链50％的温度），用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开，因为它们在不同的温度溶解。 卤素灯（白光） 线性图与对数图正好相反，基线期在对数图中增高。 基线：扩增线中的水平部分，由环境的噪音产生。 　　实验结束软件自动分析数据，基线取默认值3-15（循环数）。 　如果最小的Ct值18，保持默认； 　如果最小的Ct值18，基线终点改成［最小的Ct值减3］，重新分析。 　 荧光阈值：在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段的任意位置上。 默认阈值＝基线（