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WB 注意事项及常见问题 注意事项 一、 样本收集 1. 组织样本 原则上要求客户或我们的技术员把组织分切剪碎至研磨管 （根据实验的需要告 知他们取多少组织） ，并加入适量裂解液和研磨珠，然后放置于 -80℃保存。具体 详情参照 “组织样本收集注意事项 .doc ”； 2. 细胞样品 原则上要求客户或我们的技术员不要用胰酶把细胞消化下来， 特别是分选对象是 膜蛋白时，具体详情参照 细胞样品收集注意事项“ .doc”； 二、 总蛋白提取 1. 组织样品 具体详情参照 “组织样本收集注意事项 .doc ”；记得加入蛋白酶抑制剂，如果分选 对象是磷酸化蛋白时，记得加入磷酸化酶抑制剂； 2. 细胞样品 具体详情参照 “细胞样品收集注意事项 .doc”；记得加入蛋白酶抑制剂，如果分选 对象是磷酸化蛋白时，记得加入磷酸化酶抑制剂； 三、 蛋白样本保存 裂解细胞或组织提取总蛋白时，细胞碎片沉淀一般 -20℃保存以防万一，提取 好的蛋白样品分装 2 份，一份加入上样缓冲液变性后 -20℃保存，一份直接 -20℃ 保存； 四、 蛋白变性 提取好的总蛋白取一部分（不是全部）加入上样缓冲液进行加热变性（ 100℃， 5min ），变性好的蛋白应该 -20℃保存，冻融后不再需要加热变性； 五、 SDS 1. 浓缩胶的胶浓度一般为 5%，用于压沉样品； 2. 分离胶的胶浓度取决于分析对象的分子量大小， 详情见 Western Blotting 全攻 略 .pdf 第 4 页； 3. 分离胶和浓缩胶的高度比为 8:3； 4. 电泳结束后，应及时用清洗干净玻璃板，清洗时应使用海绵擦布，切勿使用 刷子，以免刮花玻璃板； 5. 电泳结束后，应及时冲洗电泳槽，以免盐离子沉积，导致电泳丝腐蚀； 6. 清洗电泳芯时，一定要注意别弄段电泳丝； 六、 转膜 1. 注意海绵垫，滤纸（转膜专用滤纸） ，转印膜，胶的叠放位置，以保证正确的 转印方向； 2. 注意海绵垫， 滤纸 （转膜专用滤纸），转印膜，胶的相对大小， 以免造成短路； 3. 转印结束后，应及时取出转印膜，并立即用 TBST 漂洗 1-2 遍，并立即加入 封闭液，这样可以避免膜上的杂质残留或膜变干导致背景高的问题； 4. 转印结束后，应及时冲洗转印槽和转印芯，以免盐离子沉积，导致电泳丝腐 蚀； 5. 转印结束后，应及时用水泡洗海绵垫和滤纸，以免盐离子沉积，导致转膜时 短路，并放在篮子上晾干，如果海绵垫和滤纸不及时晾干，容易导致海绵垫 和滤纸内部的结构破坏； 七、 封闭 1. 进行封闭时，应加入足量的封闭液（以完全覆盖膜为底限） ，并保证整个封闭 过程中，膜与封闭液充分接触，避免长时间离开封闭液，特别进行 4 ℃静止封闭 过夜时，一定要加入足量的封闭液和保证平坦放置； 上述注意事项主要为了避免 膜变干，导致背景升高； 八、 一抗杂交 1. 一抗的稀释比例：第一次使用时参考具体抗体说明书建议的稀释比例，并根 据实际的实验结果进行调整； 2. 杂交条件：如果是室温孵育，至少保证孵育 1-2 小时，并放置脱色摇床上进 行摇晃，如果是 4 ℃孵育，应孵育过夜，可静止亦可放置脱色摇床上进行摇 晃； 3. 应使用专用的一抗稀释液