PCR 技术在检验医学中的应用.docVIP

PCR技术在检验医学中的应用 赵建华 江苏省临床检验中心， 南京210009 1953年Watson和Crick 的DNA双螺旋结构的发现开创了分子生物学的新篇章，1976年美国华裔科学家Kan等应用液相DNA分子杂交技术成功进行了镰形细胞贫血症的基因诊断，标志着分子生物学技术进入检验领域，而1983 年美国 PE-Cetus 公司 K.B Mulliss首创的聚合酶链反应PCR技术，则完全改变了检验医学的发展，使检验医学从常规生化、免疫和微生物对疾病或病原体的表型认识和表型诊断，发展为分子诊断学在本质上认识疾病和诊断疾病，PCR技术给检验医学带来了质的飞跃。 PCR是一种极为敏感的放大工具，它能在短时间内将靶DNA 放大百万倍甚至千万倍。 　　而PCR技术指的是以PCR为基础的核酸检测技术，除靶序列的扩增放大以外，还必须包括其特异性分析检测的部分它的应用不仅能使临床常规样本的检测灵敏度极大地被提高，而且还能克服Southern 和northern印迹杂交、RFLP等传统的基因诊断技术操作繁琐，耗时和所需样本量大等缺点，尤其是近年来实时荧光定量 PCR 技术的应用对临床基因检测易污染和无法定量问题的解决，彻底打破了基因诊断技术在临床应用方面的局限性。毫无疑问，PCR技术将是检验医学未来的发展方向并成为疾病的常规诊断技术。 　　1、PCR技术在检验医学中的地位 　　人类所有疾病或健康状态都与基因有直接或间接的关系，除了外伤、极度营养缺乏等状态外，每种疾病都有其相应的致病基因和/或易感基因存在。同时，人类也是一个具有多态性的群体，不同群体和个体在对疾病的易感性、抵抗性以及其它生物学性状如对药物的反应性等方面均存在差异，该差异的基础就是人类基因组DNA序列的变异性。 　　如何探知这些基因的变异传统诊断方法是通过表现型来推测基因型，属于间接诊断而基因诊断是从基因着手来推断表现型，以探测基因的存在，分析基因的类型和缺陷及其表达功能是否正常进行诊断，属于直接诊断，不受细胞类型、发病时间和年龄等限制。随着越来越多的致病基因及其连锁DNA标记被克隆，尤其是基因组计划的实施，基因诊断正以惊人的速度向前发展。 　　PCR技术是基因诊断发展的主导方向。目前，全世界利用 PCR 技术诊断感染性疾病每年达几千万人次。1995年，美国国家临床检验标准化委员会(NCCLS) 颁布了关于感染性疾病分子诊断应用范围、条件和质量控制细则等准则文件，NCCLS分子微生物委员会主席Enns断言，以基因扩增和探针检测为主的分子生物学方法将取代传统的病原体培养和生化检测方法。1998年，国际临床化学学会发布了关于分子扩增在临床诊断中应用的质量评估基础的文件并对 PCR 操作的各个环节进行了详细论述。1999年美国研究病理学会和分子病理学协会创刊出版了《The Journal of Molecular Diagnostics 》,标志基因诊断技术已经发展成为一个成熟的学科--分子诊断学。2002年NCCLS又发布了PCR定量技术应用于传染病领域的国际标准指南，这是包括中国临床实验室标准委员会在内的一个世界范围内的指南同年，《自然遗传学》杂志发表一项调查报告“未来5至10年内最有望改善全球健康状况的十大关键生物技术”，位居第一位的就是针对传染病的分子扩增诊断技术。 　　在我国，分子诊断学得以普遍接受和较快发展是在90年代，主要归功于PCR技术的引进和应用。目前分子诊断技术已进入临床实验室，除单基因遗传病外，感染性疾病、肿瘤、基因多态性和多基因遗传病等也被纳入分子诊断的范围，几乎所有的实验方法都建立在PCR的基础上，如PCR结合寡核苷酸探针法用于感染性疾病和已知基因突变的多种遗传病的诊断等等，标志着以PCR为基础的分子诊断技术作为临床常规检验技术具有巨大的应用潜力。 PDF 文件使用 pdfFactory Pro 试用版本创建 2、PCR技术在检验医学中的应用 　　2.1感染性疾病中的应用 　　目前PCR技术在感染性疾病中的应用最为广泛和成熟，已用于几十种感染性疾病的诊断和治疗监测，致病微生物涉及病毒、细菌、衣原体、支原体和螺旋体等，只要阐明其部分核酸序列，就可以利用PCR技术检测到任何有限的病原体，检出限一般实验室可达10-100个基因拷贝，是核酸杂交检测的几千倍，抗原抗体检测的几百万甚至几千万倍。 　　1定性检测--病原学确证诊断 　　可用于各种感染性疾病的病原学诊断。目前在临床上主要用于一些不易分离培养、生长缓慢或不能培养的，血清学方法不能明确的以及存在检测灵敏度低问题的如低持续感染乙肝患者病原体的检测另外，当血清学方法不能判定是现症感染还是既往感染时，也需要利用PCR方法来确定，如目前还无法进行丙肝抗原的检测，