肽结合力与稳定性实验相关知识.docVIP

本科生毕业设计相关内容 课题背景知识： CD8+T细胞免疫应答中起重要作用。CD8+CTL(CytotoxieTlymphoeyteepitopes)对靶细胞发挥杀伤作用，必须能识别靶细胞表面与相应MHC-I类分子结合的特异性抗原表位，即CTL表位。课题组已经根据抗原的一级结构，采用免疫信息学手段，对蛋白抗原的HLA-A＊2/ HLA-A3限制性CTL表位进行了预测分析，初步筛选到表位。通过T2细胞结合力以及稳定性试验，对初步筛选的表位进行验证，获取与HLA分子具有高结合力的表位，用于后续体外免疫活性检测。 T2细胞结合力实验相关文献 （一）理论知识 1 什么是T2细胞? T2细胞是内源性抗原提呈途径中必需的抗原多肽转运蛋白(TAP)缺陷的细胞株 ADDIN NE.Ref$200805091742084633 [1] ，为HLA-A2 阳性的T, B 淋巴细胞杂交瘤细胞，可用于研究抗原递呈过程和T细胞与MHC- 分子的相互识别 ADDIN NE.Ref$200805091742084616 [2] 。 2 为什么要做结合力试验? MHC-I类分子与CTL表位的有效结合是特异性细胞免疫应答的一个重要环节。因为个体内仅存在少数几个型别的MHC-I类分子，由于每个MHC-I类分子可与一系列同种类的抗原肽结合.进而形成多种多样的MHC-肽复合物，这样就使机体免疫系统可以针对众多抗原发生特异性的免疫应答。另外，在细胞外游离肽浓度近乎为零的环境中，MHC-I类分子还必须使相应的抗原肽在细胞表面保留足够长的时间，实现特异性CD8+ T细胞对它的识别。有文献报道 ADDIN NE.Ref$200805091742086111 [1] 绝大多数CTL表位以高或中等亲和力与MHC-I类分子有效结合。 3 什么是T2细胞结合力实验? 由于T2其自身不能提呈抗原肽到HLA-I类分子上，所以T2细胞表面空载的HLA-A2分子表达极不稳定，表达后很快降解。但当有外源性抗原肽与之结合后，HLA-A2的表达就被稳定。抗原肽与HLA-A2的结合力越强，则T2细胞表面HLA-A2分子的降解就越少，表现为表达量越高。T2表面HLA-A2分子表达量的增加直观地反映了外来抗原肽与HLA-A2的结合力 ADDIN NE.Ref$200805091742088562 [1] 。 4 怎么设计候选表位肽T2细胞的结合力实验?（1）阳性对照，文献中报道的大家公认的与T2细胞有强的结合力的多肽；（2）阴性对照，单纯的PBS；（3）背景对照，不用多肽冲击的T2细胞；（4）肽与T2细胞的结合力的判定依据：A、浓度对比法来表示待测肽与HLA的相对亲和力(RA)。RA=诱导HLA表达20%的待测肽的浓度/诱导HLA表达20%的阳性肽的浓度，RA值越小，肽与HLA的亲和力越强 ADDIN NE.Ref$200805091742098378 [3-4] 。B、间接免疫荧光法检测各肽与HLA-A2.1分子的结合情况。外源性多肽与T2细胞表面MHC I类分子的结合可使其表面MHC I类分子的表达量增加，两者结合越稳固，可检测到的MHC I类分子越多，最终以平均荧光强度为检测指标，以荧光系数（FI）作为衡量指标 ADDIN NE.Ref$200805091742097310 [1-2, 5] 。尽管不同的文献报道的FI的算法略有差别。 （二）具体实验方法 1 Measurement of peptide relative affinity (RA) for HLAA*0201. （1）Briefly, T2 cells were incubated with various concentrations of peptides (0.1–100μM) for 16 hours and then stained with the mAb BB7.2 to quantify the surface expression of HLA-A*0201. For each peptide concentration, the HLA-A*0201-specific staining was calculated as the percentage of the staining obtained with 100 μM of the reference peptide HIVpol589 (IVGAETFYV). The RA is determined as the ratio between the concentration of each peptide and the concentration of the reference peptide that indu